Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

1.5. Металлозависимые матриксные протеиназы (МПП) и тканевые ингибиторы металлопротеиназ матрикса (ТИМП)

К числу компонентов, синтезируемых эндогенно и способных аккумулироваться и сохраняться в костно-хрящевом матриксе человека и животных, Риггз и Мелтон (2000) относят:

1) ферменты, участвующие в деградации матрикса;

2) тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИПМ);

3) активатор плазминогена и его ингибитор.

В деградации хрящевого матрикса в различной степени и при различных условиях принимают участие четыре основных класса протеиназ: сериновые (трипсиновые, химотрипсиновые протеиназы, эластаза), цистеиновые протеиназы (катепсин В и Н), аспарагиновые протеиназы (пепсин, катепсин D) и металлопротеиназы (коллагеназы, желатиназы, стромелизин). Матриксные металлопротеиназы(ММП) – принимают участие в деградации всех белков матрикса, как в процессе онтогенеза, так и при дегенеративных изменениях хрящевого и костного матрикса (Риггз, 2000; Хасигов, 2001; Tryggvason et al., 1987; Fosang et al., 1996; Stracke et al., 2000). Наиболее изученными из них являются коллагеназы (КФ 3.4.24). В настоящее время известны четыре представителя этого семейства: интерстициальная коллагеназа І типа (ММП-1), коллагеназа нейтрофилов (ММП-8), коллагеназа 3 (ММП-13), коллагеназа 4 (ММП-18).

Коллагеназы – это ферменты семейства металлозависимых протеиназ матрикса, способные гидролизовать нативный коллаген. Эти ферменты играют решающую роль при развитии таких физиологических процессов как морфогенез, резорбция и ремоделирование тканей, миграция, адгезия, дифференцировка и пролиферация клеток (Docherty et al., 1992; Демина, Лысенко, 1996; Соловьева, 1994, 1998), а также при патологических состояниях (ревматоидный артрит, пародонтиты, изъязвления роговой оболочки глаз и т.д.).

Все ферменты этого семейства обладают общими характерными чертами:

1) содержат цинк в активном центре и относятся к кальцийзависимым протеиназам;

2) ингибируются хелатными агентами;

3) обладают сходной доменной структурой;

4) гидролизуют один или несколько компонентов матрикса и базальных мембран;

5) секретируются в виде проферментов;

6) проферменты активируются рядом протеиназ, тиолмодифицирующими агентами и хаотропными реагентами;

7) ингибируются тканевыми ингибиторами (Соловьева, 1994).

Коллагеназы гидролизуют интерстициальные нативные коллагены, в спиральной области, устойчивой к действию других протеиназ, по связи Gly-Leu (Ile), расположенной на расстоянии 1/4 длины молекулы от С-конца. Некоторым видам коллагеназ для эффективного связывания коллагена требуется достаточно протяженный участок его структурированной молекулы, что обозначает важную роль и каталитического, и субстрат-связывающего С-концевого доменов для взаимодействия с субстратом (Соловьева, 1998).

В норме процессы синтеза и расщепления гликозаминогликанов и коллагена находятся в равновесии. При воспалительных процессах, таких как артрит, происходит деполимеризация хрящевой ткани интерстициальными ферментами, сопровождаемая болезненным состоянием суставов. Исследования причин и непосредственно последствий артрита у человека и животных выявили повышенную концентрацию коллагеназы в местах деградации хряща (Воли, 1991; Milner, Elliott, Cawston, 2000; Данилевская, Николаев, 2002). Методами гистохимического окрашивания было показано, что на разрушающейся поверхности не было постоянных доминирующих специфичных клеток, которые выделяют коллагеназу, но были обнаружены макрофаги, фибробласты, нейтрофилы, хондроциты и тучные клетки (Воли, 1991). Выявление скоплений тучных клеток в местах разрушений представляет несомненный интерес, так как эти клетки отвечают за выделение медиаторов и гидролитических ферментов.

Чаще всего запуск деградации тучных клеток осуществляет иммуноглобулин Е (Ig E), который образуется в организме. Подтверждением этого служат данные, согласно которым в синовиальной жидкости, взятой у больных ревматоидным артритом, содержатся антитела к Ig E, специфичные к коллагену хряща (Воли, 1991). Это означает, что у больных аутоиммунный ответ направлен против компонентов хряща, что приводит к образованию Ig Е-антител и к повышению чувствительности тучных клеток. При этих условиях хрящ становится как бы «чужеродной тканью», которая должна быть удалена при опосредованном участии компонентов, выделяемых тучными клетками. Несмотря на отсутствие способности разрушать сам коллаген, содержимое гранул тучных клеток (в частности, гистамин) может стимулировать продукцию коллагеназы в хондроцитах. Кроме того, тучные клетки способны воздействовать на макрофаги. Последние в результате вырабатывают фактор, идентифицированный как интерлейкин I, стимулирующий продукцию коллагеназы фибробластами. Схема, отражающая сложный механизм выделения интерстициальных коллагенолитических ферментов, в упрощенном варианте представлена на рис. 5.

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая хронический цикл воспаления, характерный для ревматоидного артрита. Показаны возможные клеточные взаимодействия, приводящие к образованию разрушающих хрящ ферментов (Воли, 1991)

Биологические функции ММП реализуются в очень широком круге физиологических процессов. Это эмбриональное развитие и морфогенез, метаморфоз и ангиогенез. Особое место отводится металлопротеиназам в генерализации процессов инвазии и метастазирования опухолей (Tryggvason et al., 1987; Соловьева и др., 2001; Луценко и др., 2003). Получены данные, указывающие на наличие единого рецепторного механизма в регуляции процессов деградации матрикса и миграции клеток, что в конечном итоге обеспечивает инвазию и метастазирование. Решающим фактором в действии ММП является соотношение ферментов и их эндогенных ингибиторов в клетках опухоли и хозяина. Получены многочисленные данные об эффективном ингибировании процессов инвазии и метастазирования в процессах in vitro и на экспериментальных животных (DeClerk et al., 1992). В настоящее время проводятся многочисленные исследования по разработке перспективных лекарственных препаратов на основе ингибиторов ММП.

На посттрансляционном уровне в физиологических условиях известны два основных пути регуляции активности ферментов:

1) активация проферментов;

2) взаимодействие с эндогенными ингибиторами.

Химические агенты, вызывающие активацию ММП – это тимолмодифицирующие и хаотропные агенты, амино-фенилмеркурий-ацетат, окисленный глутатион. Нагревание также вызывает активацию проферментов.

Большая часть матриксных металлопротеиназ переходит в активную форму в результате сложного многоступенчатого процесса, основные этапы которого осуществляются, по-видимому, вне клетки. Активатором металлопротеиназ считают плазминоген, образующийся под влиянием тканевого активатора плазминогена, который синтезируется хондроцитами или клетками синовиальной жидкости. В нормальных физиологических условиях активность коллагеназ (способных разрушать все компоненты внеклеточного матрикса) подавляется с помощью тканевых ингибиторов металлопротеиназ (Tryggvason et al., 1987; Хасигов и др., 2001).

Тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП) продуцируются хондроцитами и препятствуют активации ферментов и их разрушительному действию на ткань хряща. Полагают, что причиной остеоартроза является нарушение баланса между указанными факторами, которое приводит к повышенному разрушению матрикса или снижению его восстановления. У больных остеоартрозом отмечали повышенную концентрацию металлопротеиназ в ткани хряща (Воли, 1991; Fosang et al., 1996; Stracke et al., 2000). В настоящее время известно о четырех членах семейства ТИМП. Наиболее распространенным ингибитором является ТИМП-1 – гликопротеин с м.м. 30 кДа, в меньших количествах встречается ТИМП-2 – негликозилированный белок с м.м. 23 кДа. Оба ингибитора легко экстрагируются из хряща (Murphy et al., 1989). Также был выделен гликопротеин с м.м. 28,5 кДа (ТИМП-3) из фибробластов кожи человека, устойчивый к крайним значениям рН (Tryggvason et al., 1987). Известно, что ТИМП-1 и ТИМП-2 существуют в растворимой форме, тогда как ТИМП-3 нерастворим и находится исключительно в связанном с внеклеточным матриксом состоянии (Хасигов, 2001).

Проявление биологической активности ингибиторов связывают с их проникновением во внеклеточное пространство. Это было показано в многочисленных исследованиях, касающихся всех соединительных тканей млекопитающих, продуцирующих ингибиторы коллагеназ. Одна из групп таких биологически активных тканевых ингибиторов включает низкомолекулярные катионные белки с м.м. в пределах 11–40 кДа (Kuettner et al., 1976, Langer et al., 1976, Tryggvason et al., 1987).

Изученные ТИМП имеют ряд одинаковых структурных особенностей. Так, в консервативной части молекулы ТИМП находятся 12 остатков цистеина, которые образуют шесть дисульфидных мостиков. У всех ТИМП N-концевой домен, необходимый для проявления ингибиторной активности, содержит консенсусную последовательность Val-Ile-Arg-Ala-Lys. Образование комплекса ТИМП с матриксными металлопротеиназами происходит с помощью нековалентных связей; при диссоциации комплекса и ингибитор, и фермент могут высвобождаться в интактном виде (Murphy et al., 1989). Было показано, что в процессе ингибирования сначала происходит обратимое связывание ТИМП-1 с С-концевой последовательностью, а затем образуется прочный комплекс ингибитора с молекулой металлопротеиназы (Хасигов, 2001). На основании исследования рекомбинантной молекулы ТИМП-1 Мёрфи с соавторами (Murphy et al., 1991) предположили, что последовательность N-концевого домена ТИМП-1 определяет его способность ингибировать ферментативные реакции с участием матриксных металлопротеиназ. В дальнейшем при помощи направленного мутагенеза было установлено, что для проявления ингибиторной активности ТИМП-1 важна последовательность, расположенная между Cys 3 и Cys 13 N-концевого домена. Ингибиторная активность ТИПМ-2 также связана с N-концевой последовательностью. Последовательность Gly-Cys-Glu-Glu-Cys, заключенная между двумя дисульфидными связями (Cys 13-Cys 124 и Cys 127-Cys 174) молекулы ТИМП-1, принимает участие в подавлении ферментативной активности коллагеназы фибробластов (De Clerck et al., 1991). Способность образовывать комплекс с неактивной формой фермента указывает на более сложные, чем простое подавление активности функции ТИМП.

В экстрактах хряща акул обнаружены низкомолекулярные белки, ингибирующие металлопротеиназы матрикса (пат. РФ 2157695). Из хрящевой ткани акул также выделен ингибитор ангиогенеза с м.м. около 10 кДа. Исследование структурных особенностей ингибитора показали, что это термоустойчивый протеогликан, содержащий цепи сульфатированного кератана и белка (Liang, Wong, 2000). Также было показано, что количество аналогичных белков в хрящевой ткани теленка в 100 раз ниже (Lee, Langer, 1983).

Таблица 3

Активаторы и ингибиторы метаболизма хрящевой ткани

Взаимосвязь между проявлением активности матриксных металлопротеиназ (коллагеназ) и их ингибиторов прослеживается при различных физиологических и патологических состояниях тканей. Ряд авторов полагает, что ТИМП способны препятствовать развитию процессов инвазии и метастазирования опухолей, в связи с чем рассматривают эти компоненты как перспективные противоопухолевые средства (Yip et al., 1999).

Суммировать данные о характере метаболизма хрящевой ткани и влиянии на него отдельных компонентов можно следующим образом (табл. 3). Эти данные позволяют проводить направленный поиск препаратов для терапии патологических состояний хрящевой ткани.