Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
3.1.2. Антитела в ИХМ
В ИХМ используются специфические, или диагностические антитела для распознавания анализируемого антигена. Получают специфические антитела с помощью различных лабораторных животных (кролик, коза, овца, лама, курица, мышь). Для этого животное иммунизируют антигеном, к которому необходимо получить специфичные антитела, либо модифицированным антигеном, дающим наилучший иммунный ответ. Например, низкомолекулярные вещества обладают слабой иммуногенностью (способностью вызывать иммунный ответ), поэтому для иммунизации используют конъюгат аналога определяемого вещества с белком-носителем. Соединение (субстанция, конъюгат), используемый для иммунизации и вызывающий в организме животного иммунный ответ, называется иммуногеном. Часто для усиления иммунного ответа животным вместе и иммуногеном вводят адъювант – специальный реагент, активирующий иммунную систему.
Процесс получения специфических антител в ИХМ является длительным и многостадийным. Основные стадии этого процесса, на каждой из которых происходит подбор условий и оптимизация процесса:
1. Подбор структуры и синтез иммуногена (конъюгата).
2. Иммунизация животного:
● вид иммунизируемого животного;
● схема проведения;
● форма представления антигена (с адъювантом или без него);
● способ введения антигена реципиенту, доза и сроки.
3. Получение и характеризация сыворотки.
4. Очистка (выделение) антител, либо получение моноклональных Ат.
Одной из основных характеристик антител является их аффинность. По аффинностью понимают силу связывания активного центра молекулы антитела с соответствующей детерминантой антигена.
Другой важной характеристикой антител (антисыворотки) является специфичность. Под специфичностью антител понимают способность антител отличать иммуноген от любого другого антигена (замена).
Специфичность получаемых при иммунизации антител к гаптену прежде всего зависит от структуры конъюгированного антигена гаптен – носитель. Другими словами, используя иммуногены различной структуры, можно получать антитела как высокоспецифичные, т.е. узнающие только определяемое вещество (или вещество и самые близкие к нему по структуре соединения), так и антитела с широким спектром специфичности, способные реагировать с родственными соединениями, например, с метаболитами.
В ИХМ используются 2 типа антител – моноклональные и поликлональные. Поликлональные антитела – антитела, образующиеся в сыворотке крови в разных клонах B-лимфоцитов и связывающиеся с различными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулы-мишени (антигена). Смесь антител, выделенную из сыворотки крови, называют поликлональным препаратом. Для получения поликлональных антител используются различные иммунизированные животные (чаще всего кролики).
Поликлональные Ат, полученные из сыворотки животного, характеризуются распределением констант аффинности (т.е. величины сродства к антигену) и некоторой полиспецифичностью. Поэтому они с успехом применяются в групп-специфическом анализе, т.е. в диагностикумах, выявляющих группу родственных веществ (например, группу опиатов: морфин, героин, кодеин и др. родственные наркотические вещества).
Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики:
● содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой;
● поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две подобные мишени, например, когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой; либо когда нужно различить два вещества из одной группы.
Для реализации вышеприведенных целей были разработаны препараты антител, специфичные к одной определённой антигенной детерминанте, то есть препараты моноклональных антител. Моноклональные антитела – антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные Ат характеризуются одной константой аффинности и узкой специфичностью. Все молекулы моноклональных Ат и, соответственно, структуры их центров связывания, являются идентичными.
Моноклональные Ат успешно применяются для создания узкоспецифи ческих тест-систем, способных опреде-лять индивидуальное вещество или узкий круг близкородственных веществ.
Например, с использованием моноклональных Ат разработаны тест-системы для определения героина (не специфичные к морфину, кодеину), экстази (неспецифичные к близким по структуре амфетамину и метамфета-мину).
Получение моноклональных Ат является длительным высокотехнологичным процессом. В данном случае в качестве иммунизируемых животных используются мыши. У иммунизированных мышей, давших хороший иммунный ответ к введенному иммуногену, отбирают лимфоузлы, содержащие большое количество B-лимфоцитов. Их смешивают с линией миеломных (раковых) клеток, которые потеряли способность синтезировать свои собственные антитела, после чего происходит гибридизация – образование гибридных клеток, интенсивно синтезирующих нужное антитело. Затем клоны гибридных клеток тести-руют, отбирают один или несколько клонов, синтезирующих Ат с нужной специфичностью, и клонируют уже отобранный нужный клон. В результате можно наработать большое количество антител заданной специфичности.
В различных вариантах ИХМ могут использоваться как поликлональные, так и моноклональные антитела, в зависимости от поставленной задачи.
Рис. 8. Схема получения моноклональных антител
В гетерогенных форматах ИХМ используется еще один вид антител – антивидовые Ат. Антивидовые антитела (т.е. антитела против вида животных) – это антитела, полученные против антител животного другого вида. Например, есть антитела «овца против кролика», «кролик против мыши», «кролик против человека» и др. Это означает, что нормальными антителами животного, против которого хотят получить антивидовые Ат, иммунизируют животное другого вида. В результате получают иммунный ответ на любые Ат первого вида. Антивидовые Ат удобно использовать для получения универсального меченого реагента – например, конъюгата с ферментом. Такой конъюгат можно использовать для выявления иммунных комплексов с антителами любой специфичности, полученных у данного вида животного. Т.е., например, для ИФА наркотических веществ любого класса можно использовать один меченый ферментом реагент (см. раздел Иммуноферментный анализ).