Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОСНОВНЫХ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ

Сафиуллин А. А.,

6.3. Результаты определения местного иммунитета полости рта

Всего было проведено 70 исследований иммунного статуса в I триместре у 70 беременных женщин. Венозная кровь забиралась однократно, в количестве 8-10 мл, натощак, без предварительной подготовки. Исследования проводились в клинико-диагностической лаборатории Нижегородского областного медицинского диагностического центра.

Оценка иммунного статуса беременных женщин проводилась с определением лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, клеточного (Т- и В-лим-фоцитов) и гуморального звеньев иммунитета (IgA, IgG, IgM и ЦИК).

Для расчёта количества лейкоцитов в 1 мкл крови в пробирку наливают 0,4 мл раствора уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синью. Набирают 0,02 мл крови, осторожно выдувают её в пробирку с реактивом и ополаскивают пипетку. Кровь, разведённую в пробирке, хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева [102]. Лейкоциты подсчитывают при малом увеличении в 100 больших квадратах, что соответствует 1600 малых (100x16).

где X – количество лейкоцитов в 1 мкл крови;

а – количество форменных элементов, сосчитанных на 100 больших квадратах;

1600 – количество малых квадратов;

20 – разведение крови;

4000 – множитель, приводящий результат к объёму 1 мкл крови исходя из объёма малого квадрата (1/4000);

В норме в 1 мкл крови содержится от 4000 до 9000 лейкоцитов.

Изучение лейкоцитарной формулы – процентного соотношения различных видов лейкоцитов – осуществлялось при микроскопии сухих фиксированных и окрашенных мазков крови с дифференцированием различных форм лейкоцитов. При микроскопии используется иммерсионный объектив (х00). Просчитывается не меньше 100 лейкоцитов (около половины клеток на одном крае мазка, затем меняется положение стекла и считается на противоположном крае), соблюдая следующие правила: отступив 2-3 поля зрения от края мазка, затем 3-5 полей зрения под прямым углом по направлению к краю, двигая стекло по зигзагу.

В норме лейкоцитарная формула представлена:

1. палочкоядерные нейтрофилы 1-6%;

2. сегментоядерные нейтрофилы 47-72%;

3. эозинофилы 0,5-5% • базофилы 0-1%;

4. лимфоциты 19-37%;

5. моноциты 3-11%.

Определение Т-лимфоцитов (реакция Е-розеткообразования) проводится методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, основанного на том, что эритроциты барана образуют фигуру «розетки» вокруг Т-лимфоцитов человека. Для выполнения реакции 0,1 мл взвеси мононуклеаров (2x106 клеток в 1мл) и 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитов барана сливаются в силиконовую пробирку для агглютинации, инкубируются 10 мин при 37°С, затем центрифугируются 10 мин при 150g и помещаются в холодильник (+4°С) на 1 час. После чего к смеси добавляли 0,05 мл раствора глутарового альдегида и инкубировали при комнатной температуре 20 мин. Затем к смеси клеток добавляли 1 мл дистиллированной воды, центрифугировали при 150g 10 мин. Отбрасывали 1 мл супернатанта, оставшиеся 0,2 мл ресуспендировали пастеровской пипеткой и наносили на предметное стекло. Полученный препарат высушивали, окрашивали метиленовым зелёным-пиронином, промывали и подсчитывали под микроскопом с использованием иммерсионного объектива число Е-розеток (лимфоцитов, связавших 3 и более эритроцитов) среди 300 просмотренных лимфоцитов. Число Е-розетко-образующих клеток выражается в относительной величине (в%) и абсолютной, исходя из общего числа лимфоцитов периферической крови обследуемого.

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов проводится методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана при обработке теофиллином. При обработке теофиллином часть Т-лимфоцитов перестаёт реагировать с эритроцитами барана с образованием так называемых «розеток», причём показано, что среди теофиллин-чувствительных клеток преобладают клетки с супрессорной и цитотоксической активностью. Теофиллин-резистентные клетки в основном представлены Т-лимфоцитами, выполняющими функцию клеток-помощников (Т-хелперы).

Определение В-лимфоцитов проводится методом розеткообразования с эритроцитами мыши, которых заключается в образовании «розеток» эритроцитами мыши вокруг части В-лимфоцитов человека, несущих преимущественно поверхностные IgM. Для выполнения реакции 0,1 мл взвеси МНК и 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитов мыши наливали в силиконовую пробирку для агглютинации, центрифугировали 10 мин при 150g , затем инкубировали при комнатной температуре 2 часа. После чего добавляли 0,05 мл раствора глутарового альдегида и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Последующие этапы реакции идентичны реакции Е-розеткообразования, описанной выше.

Определение иммуноглобулинов венозной крови проводили методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле по G. Manchini, A. Carbonara, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяли относительно стандартной сыворотки крови человека с известной концентрацией иммуноглобулинов. Моноспецифические сыворотки против IgG (H+L), IgG (Н), IgA (Н), IgM (Н) представляют собой сыворотки из крови кроликов или овец, гипериммунизированных иммуноглобулинами сыворотки человека (IgG, IgA, IgM).