Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
8.1 Диагностика маркёров плода в материнской крови
Несмотря на то, что существует популярное мнение, что плацента образует барьер между матерью и ребенком, это не так (Lo et al., 1996). Многочисленные исследования показали, что как целые клетки плода, так и внеклеточные фетальные ДНК проходят через плаценту и циркулируют в материнском кровотоке.
Интактные фетальные клетки, циркулирующие в материнском кровотоке, являются привлекательной мишенью для неинвазивной пренатальной диагностики, а именно для диагностики резус-фактора, пола плода и хромосомных аномалий путем простого кариотипирования. Хотя существование фетальных клеток в материнской крови известно более века, непосредственно интактные фетальные ядерные красные кровяные клетки с целью пренатальной диагностики не использовались до 1990 года (Bianchi et al., 1990). С этого времени выделение и обнаружение клеток плода из крови матери стало интенсивно изучаться (Bianchi, 1999; Jackson, 2003), и стали появляться различные методы выделения фетальных клеток, которые были в разной степени успешными (Stkizava et al., 1997). Однако результаты исследований разочаровывали. Это было обусловлено недостаточностью интактных клеток плода циркулирующих в материнском кровотоке (около 1 клетки в миллилитре материнской крови) (Bianchi et al., 1997), низкой эффективностью исследований (Bianchi et al., 1997) и трудностями, с хромосомными анализами, связанными с ненормально пустыми ядрами в некоторых клетках (Babochkina et al., 2005). Хотя некоторые клетки плода (в частности ядерные красные кровяные клетки плода) имеют сравнительно короткую продолжительность жизни в материнской крови (Lurie и Mamet, 2000), фетальные клетки других типов могут сохраняться в материнской крови десятилетия после беременности (Bianchi et al., 1996) и потенциально способны вызвать ложноположительные результаты при последующих беременностях. Таким образом, хотя современные исследователи пытаются улучшить технику сортировки клеток, большинство последних научных исследований сосредоточены на бесклеточной ДНК плода в крови матери, которая представлена в достаточном количестве (Lo et al.б1998 b).
Несмотря на то, что огромное количество человеческой ДНК расположено внутри клетки, присутствие небольшого количества внеклеточной ДНК (вкДНК) в циркуляции и здоровых и больных женщин было открыто в 1947 (Mandel и Metais, 1948). Хотя их биологический источник и потенциальная функция остаются неопределенными (Stroun et al., 2000), предполагают, что это продукт апоптоза, в результате которого происходит фрагментация и выход хромосомных ДНК из клетки (Jahr et al.,2001). Увеличение концентрации вкДНК в плазме пациентов, больных раком, было доложено в 1997 году (Leon et al.,1977), но этому не предавалось значение до 1997 года, когда присутствие ДНК плода в материнском кровотоке было продемонстрировано Lo et al. В 1997 году.
Фетальные ДНК образуются путем апоптоза плацентарных клеток (трофобласта) полученных от эмбриона (Tjoa et al.,2006; Alberry et al.,2007) и составляют примерно 3-6% от общих вкДНК в материнском кровотоке в начале и конце беременности, соответственно (Lo et al. 1998b) (оставшиеся 94-97% составляют материнские вкДНК).
В отличие от клеточной ДНК, циркулирующие внеклеточные фетальные ДНК (вкфДНК) состоят в основном из коротких фрагментов ДНК, а не целых хромосом, из которых 80% более 193 пар оснований в длину (Chan et al., 2004). ДНК плода можно обнаружить с 4-й недели беременности (Illanes et al., 2007), хотя надежно только с 7 недель, концентрация его возрастает с увеличением гестационного возраста - от эквивалентных 16 фетальных геномов на миллилитр крови матери в первом триместре беременности до 80 в третьем триместре (Birch et al., 2005) - с острым пиком в течение последних 8 недель беременности (Lo et al., 1998b;.. Birch et al., 2005). В отличие от фетальных клеток, вкфДНК быстро выводится из крови матери с полураспадом 16 мин и не определяется через 2 ч после родов (Lo et al., 1999c). Хотя исследование в 2002 году показало, что вкфДНК может быть обнаружена в материнской плазме в течение 10 лет после беременности (Invernizzi и et al., 2002), это открытие не было подтверждено и было приписано к загрязнению ДНК клетками плода в связи с конкретным способом добычи (Tomaiuolo et al., 2007). Обращает на себя внимание, что вкфДНК также может быть обнаружена в течение нескольких дней после прекращения беременности (Wataganara et al., 2004a).
Кроме того, бесклеточная фетальная мРНК (бкфРНК) также была обнаружена в материнском кровотоке в 2000 году (Poon et al., 2000), она была получена из генов, которые однозначно активно представлены в плаценте. Хотя большинство работ на сегодняшний день сосредоточены на вкфДНК, оба типа внеклеточных нуклеиновых кислот, т.е. ДНК и РНК, потенциально могут быть использованы для неинвазивной пренатальной диагностики для специфической генетической характеристики плода.
Обнаружение вкфДНК
Отличить или идеально изолировать, полученные бесклеточные фетальные ДНК среди подавляющего большинства бесклеточных материнских ДНК представляет собой значительные технические трудности.
Есть целый ряд общих проблем, связанных с обнаружением вкфДНК в крови матери:
(1) концентрация всех бесклеточных ДНК в крови относительно невелика;
(2) общее число бесклеточных ДНК варьирует у разных людей;
(3) молекулы вкфДНК в меньшинстве 20:1 по отношению к молекулам материнской бесклеточной ДНК;
(4) плод наследует половину генома от матери.
Были разработаны несколько методов для решения этих проблем. Первоначально бесклеточные ДНК должны быть отделены от остальной части крови. После того, как образец крови матери был взят, плазма отделяется от клеток путем центрифугирования. За этим следует выделение и очистка всех бесклеточных ДНК. Выход бесклеточных ДНК варьирует в зависимости от различных способов обработки (Chiu et al., 2001. Randon et al., 2003) и является ограничивающим фактором для генотипирования плода по крови матери. Хотя методологии в настоящее время меняются, была проведена оценка различных протоколов и впоследствии инициирован процесс стандартизации для извлечения вкфДНК из материнской плазмы (Legler et al., 2007).
В первую очередь фрагменты вкДНК очищаются, небольшие различия между материнскими и фетальными последовательностями ДНК используются в целях проведения специфической фетальной диагностики. На сегодняшний день большинство исследований направлены на выявление последовательностей, унаследованных от отца, полностью отсутствующих в материнском генотипе, например, на Y хромосоме мужского плода. Эта задача является особенно привлекательной, так как включает в себя большую часть ДНК, которая не присутствует у женщин. Вариабельность участков повторяющейся ДНК может быть использована для идентификации последовательностей, унаследованных от отца, путем сравнивая количества повторений представленных в отцовских и материнских последовательностях. Отцовские аллели, которые наследуются по аутосомно-доминантному типу, также могут быть обнаружены, если они, как известно, отсутствуют в материнском геноме. Но для этого требуется детальное знание последовательностей отцовского генотипа, а также методы обнаружения, которые могут различать последовательности ДНК, которые могут отличаться лишь по одному нуклеотиду. Важно отметить, что все эти методы полагаются на то, что плод наследует отцовскую последовательность, которая является удобно расположенной для диагностики.
Наиболее общая техника, используемая для обнаружения и идентификации специфических последовательностей вкфДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Используются различные типы ПЦР, но наиболее популярная из них количественная ПЦР в реальном времени (Traeger-Synodinos, 2006), так как эта комбинация наиболее чувствительная в закрытой исследуемой системе, таким образом, снижается риск загрязнения.
Другая чувствительная техника, которая так же может быть использована для идентификации вкфДНК это масс-спектрометрия (Ding et al., 2004). Как и во всех тестах, точность и надежность обнаружения может быть значительно повышена за счет увеличения отношения сигнал-шум. Есть два альтернативных метода, конкретно направленных на увеличение доли ДНК плода по отношению к материнской ДНК в образце:
1. Селективное увеличение фетальной ДНК, основанное на разнице в средней длине фетального и материнского фрагментов ДНК, которые могут быть использованы для увеличения относительного количества вкфДНК. Полученные фрагменты фетальной ДНК, как правило, меньше, тех, которые материнского происхождения, их размер преимущественно менее 313 пар оснований в длину (Chan et al., 2004). Таким образом, с помощью стандартного режима фракционирования, для выбра только фрагментов ДНК размером более 300 пар оснований, циркулирующие вкфДНК могут быть выделены такими, что их содержание будет около 70% от общей внеклеточной ДНК (Li et al., 2004b). Это будет сделано до обнаружения и идентификации либо методом ПЦР (Li et al., 2005) или с помощью масс-спектрометрии (Li et al., 2006).
2. Супрессия материнской ДНК путем добавления формальдегида (Dhallan et al., 2004). Формальдегид - химическое вещество, которое, как полагают, стабилизирует нетронутыми клетки, тем самым препятствуя дальнейшему выпуску материнских ДНК в образец и увеличению удельного веса ДНК плода. Тем не менее, использование формальдегида для этой цели является спорным, так как относительное выделение ДНК плода из этого процесса весьма нерегулярное; доклады свидетельствуют о широком диапазоне результатов, варьирующих от 5% до 96% от общих бесклеточных ДНК (Benachi et al., 2005), и повторяемость опубликованного протокола была поставлена под вопрос несколькими исследованиями (Chinnapapagari et al., 2005; Chung et al., 2005).
Универсальные маркеры плода
Важнейшие исследования направленны на поиск универсальных специфичных маркеров плода, которые могут быть использованы либо в качестве диагностических тестов сами по себе или для подтверждения и количественного присутствия ДНК плода независимо от пола или других специфических диагностических тестов. Универсальные фетальные маркеры могут быть использованы наряду с клинически значимыми диагностическими тестами в качестве положительного контроля на наличие вкфДНК, для того, чтобы отобрать ложно-отрицательные результаты или вызванные низким уровнем циркулирующих ДНК ниже предела обнаружения, или проблемами с процессом извлечения ДНК.
Один из методов при исследовании является выявление специфических последовательностей ДНК расположенных на аутосомных хромосомах, которые могут быть унаследованными от отца. Он включает:
1. Одиночные полиморфные нуклеотиды, или точечные мутации, которые различны у материнского и отцовского геномов, но не могут быть непосредственно связаны с конкретным заболеванием. Есть ряд исследований, подтверждающих, что этот метод обнаружения возможен (Li et al., 2006;. Dhallan et al., 2007). Тем не менее, он опирается на избирательное обогащение вкфДНК с последующим анализом высокочувствительным методом, таким как масс-спектрометрия, так как материнский и фетальный генотип в данном вопросе отличаются всего на одну пару оснований делая их сложно отличимыми. Он также опирается на вывод одиночных полиморфных нуклеотидов, которые различны между материнском и отцовским (и, следовательно, фетальным) геномом.
2. Полиморфные сегменты ДНК, которые различны у материнского и отцовского геномов, такие как последовательности одиночных полиморфных нуклеотидов (ОПН). Из-за сильно вариабельной природы ОПН, большинство людей будут обладать двумя аллелями по одному от каждого родителя, с различным числом повторов. Таким образом, отцовски унаследованная последовательность у плода ОПН будет отличаться числом повторов от материнской последовательности. Амплификация этих последовательностей ОПН дает в результате два основных продукта, соответствующих материнским аллелям (и материнского унаследованного аллеля плода) и один меньший продукт, соответствующий унаследованному от отца аллелю плода. Этот метод был впервые доложен в 2000 (Pertl et al., 2000) и впоследствии был разработан с использованием одновременной детекции нескольких различных регионов ОПН в режиме реального времени ПЦР (Liu et al., 2007). Подобная методика была применена к вставки-удалению аллелей (Page-Chtiaens et al., 2006). Тем не менее, техника еще не оптимизирована для клинико-диагностического использования и чувствительность, и специфичность не были установлены.
Другой метод для выявления фетальной ДНК — это использование различий в активации генов между матерью и растущим плодом. Есть несколько биологических механизмов, которые могут быть использованы для этой цели:
1. Эпигенетические модификации, специально метилированые ДНК некоторых генов, которые отличаются между клетками матери по отношению к растущему плоду - гены, которые важны для роста и развития могут быть метилированы (замолчать) у взрослых, но неметилированным (активны) у развивающегося плода. В этих случаях фетальные аллели могут быть отделены от материнских аллелей. Анализируя различия в модификации ДНК, используют либо метилирование чувствительной ПЦР или бисульфатное секвенирование (Poon et al., 2002). Недавние исследования показали, что промоутерyтерные области двух генов супрессоров опухолей-maspin (Chim et al., 2005) и RASSF1A (Chan et al., 2006b)-по-разному метилируется в плаценте (и ДНК из клеток, полученных в них) по отношению к материнским клеткам, обеспечивая первый по-настоящему универсальный маркер для ДНК плода.
2. Обнаружения мРНК, полученной из генов, которые однозначно активны в плаценте или у плода. Наличие мужской фетальной РНК в крови матери было впервые продемонстрировано в 2000 году с помощью РНК происходящей от Y хромосомы плода мужского пола (Poon et al., 2000), из плаценты (Ng et al., 2003). Впоследствии фетальная транскриптомика была использована для идентификации многочисленных фетальных / плацентарных видов РНК из аутосомальных хромосом, которые являются уникальными для плода и обнаруживаются в плазме матери (Oudejans et al., 2003;.. Go et al., 2004; Tsui et al., 2004;. Tsui и Lo, 2006). Как вкфДНК, так и вкфРНК обнаруживаются в крови матери в первом триместре и быстро выводятся после рождения, с периодом полураспада 14 мин (Chiu et al., 2006). Так как экспрессия определенных генов является уникальной для беременных, обнаружение плацентарной / фетальной РНК является весьма перспективной для исследования, так как ее относительно легко изолировать полностью от фоновой материнской РНК.
3. Выявление белков, полученных из генов, которые однозначно выражаются в плаценте или у плода. Плацентарная экспрессия генов может выражаться в потенциально диагностических белках плода в материнской крови (Avent et al., 2008). Тем не менее, исследование фетальной протеомики в настоящее время только начинается, прежде всего с целью улучшения панели сывороточных маркеров, используемых в скрининге.