Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
8.2 Клиническое применение пренатальной неинвазивной диагностики
В связи с трудностями изоляции вкфДНК из материнского кровообращения, ее диагностические возможности в настоящее время ограничены известными различиями между генами матери и плода. Важно подчеркнуть, что полное генотипирование плода не мыслимо при использовании вкфДНК в материнском кровообращение, и что генетическая информация, полученная из вкфДНК является полностью ограничена определенной последовательностью обнаруженной ДНК (или хромосомы). Однако, с учетом современных высокопроизводительных технологий, таких как ДНК-микрочипирование (Ge et al., 2006), тысячи различных последовательностей потенциально могут быть обнаружены одновременно, для постановка различных диагнозов.
Есть целый возможностей клинического применения анализа вкфДНК в пренатальном скрининге и / или диагностики, основанный на четких и обнаруживаемых различиях между геномами матери и плода:
1. Определение пола, путем обнаружения вкфДНК последовательностей Y хромосомы;
2. одного гена расстройства, путем определения унаследованного аллеля от отца в вкфДНК;
3. связанные с беременностью расстройства, определяемые наличием рабочей копии гена резус;
4. анеуплоидии, путем обнаружения ненормальной концентрации определенной хромосомы, возможно, с использованием вкфРНК специфичной для плода и хромосомы.
Клинически эти пункты могут быть применимы для определения пола плода и нарушений одного гена медицинскими специалистами в семьях высокого риска, а также для скрининга беременных женщин на резус-фактор и анеуплоидию как часть рутинного дородового наблюдения.
Есть целый ряд технических и клинических препятствий на пути достижения высокой диагностической точности в любом из этих пунктов. Результаты могут быть ложноотрицательными из-за неспособности извлечь или обнаружить достаточное количество материала. Это связано с индивидуальной вариабельностью в размере от общего числа бесклеточных ДНК и небольшой долей вкфДНК по сравнению с внеклеточной материнской ДНК; ложноположительные результаты могут быть либо техническим вопросом, таким как загрязнение или клинические отклонения такие, как наличие неодинаковых исчезающих близнецов. Таким образом, обширные клинические испытания необходимы для каждого пункта, чтобы оценить какие методы могут быть надежно использованы в клинических условиях. Клиническое применение техники и ее социоэтические последствия будут варьироваться, а также будет необходима полная оценка в целях обеспечения возможности доставки, равенства доступа и ценность для пациентов.
Заболевания, связанные с беременностью
Есть целый ряд связанных с беременностью расстройств, которые могут быть обнаружены с использованием вкфДНК в качестве маркера для благополучия плода и матери. Они могут подразделяться на две категории, как с точки зрения основных патологией и предлагаемых диагностических методов:
1. Определение резус-фактора плода, путем обнаружения гена резус-фактора;
2. Ненормальное формирование и функционирование плаценты, в результате чего концентрация вкфДНК будет повышена. Она в данном случае может быть использована в качестве диагностического маркера.
В связи с темой данного научного исследования подробно остановимся на вопросе определения резус-фактора.
Резус-фактор
К резус-системе крови относятся пять основных резус-антигенов (C, C, D, E и д) на поверхности красных кровяных клеток. RhD антиген, или резус-фактор (RHD), на сегодняшний день является наиболее распространенным. По наличию или отсутствию RHD гена судят о резус-принадлежности.
RhD антиген присутствует у более чем 80% населения Кавказской популяции (хотя эта цифра варьирует в различных этнических группах) (Wagner et al., 1995. Daniels, 2005) и является причиной большинства случаев материнской иммунизации (Avent и Reid, 2000). В настоящее время, этот иммунный ответ в значительной степени снижен благодаря введению анти-D антител матери, которые вводят во время третьего триместра беременности и сразу после рождения, они связывают и нейтрализуют резус-антигены плода.
Сведение к минимуму профилактического применения антирезус-иммуноглобулина считается желательным так как он теоретически может быть источником инфекции, поскольку он выделен из крови доноров. Хотя определение резус-фактора плода может быть достигнуто путем амниоцентеза или кордоцентеза, но эти методы не только опасны как для матери, так и для плода, но и могут привести к резус-сенсибилизации. Неинвазивная пренатальная генетическая диагностика резус-фактора плода по крови резус-отрицательной беременной женщины может быть использована для решения этой проблемы. Она была впервые применена в 1998 году (Lo et al.,), после чего она была тщательно разработана. Подход к пренатальной неинвазивной диагностике ГБПиН базируется на том, что в образце присутствуют последовательности ДНК, отсутствующие у матери, то есть гена RHD.
Джеймс Ло с соавторами в 1997 году впервые показали наличие фетальной свободной ДНК в плазме крови беременной женщины. ДНК плода проникает в материнский кровоток за счет апоптоза клеток плаценты и деградации клеток плода и может быть обнаружена с 5 – 6 недели гестации.
Стандартным методом для выявления ДНК плода в крови является ПЦР-амплификация 7 и 10 экзонов RHD гена в реальном времени. Он обладает высокой чувствительностью и специфичностью гена.
Неинвазивная пренатальная диагностика, чтобы быть доступной для всех резус-отрицательных беременных женщин, должна обладать высокой пропускной способностью, например, в Великобритании ежегодно наблюдаются около 100 000 резус-отрицательных беременных женщин (Pilgrim et al., 2007). Большинство НИПД резус-фактора проводится с использованием вкфДНК с использованием количественной ПЦР в реальном времени (Geifman-Holzman et al., 2006) для выявления наличия гена RHD у резус-отрицательной матери.
Успехи развитых стран в последние десятилетия в решении проблемы гемолитической болезни плода и новорожденного, вызванной путем резус-иммунизации, достигнуты путем обязательного профилактического применения анти-D-иммуноглобулина у женщин с резус-отрицательной кровью. Это позволяет говорить и о возможности решения данной проблемы в России. Тем не менее, отсутствие обязательной общегосударственной программы, следовательно, и отсутствие повсеместного применения профилактики резус-иммунизации у женщин репродуктивного возраста, дают возможность утверждать, что проблемы диагностики и лечения гемолитической болезни плода и новорожденного останутся актуальными в нашей стране достаточно долго.
В настоящее время частота смертности при тяжелых случаях гемолитической болезни продолжает снижаться. Это связано с совершенствованием методов неонатальной помощи [1-8]. Так, в результате ретроспективного анализа исходов беременности у женщин с резус-отрицательной кровью рожавших в родильном доме при городской клинической больнице № 2 им. Н.А. Семашко, были получены следующие данные. Количество новорожденных с диагнозом ГБН не имеет тенденции снижению и остается примерно на одном уровне: 3 – 5% от общего числа родов у женщин с резус-отрицательной кровью. Количество новорожденных с тяжелой желтушной формой и отечной формой ГБН так же остается примерно на одном уровне [9-16]. Но количество заменных переливаний крови значительно снижается. Так если в 2007-2009 годах оно проводилось всем новорожденным с тяжелой желтушной формой и отечной формой ГБН, то, начиная с 2010 года, этот показатель начинает снижаться, и в 2012 году заменное переливание крови проводится 37% детей. Данная динамика наглядно показывает улучшение неонатальной помощи. Но, несмотря на такие хорошие результаты, задачей каждого акушера-гинеколога является предупредить заболевание, а не бороться с его последствиями.
Кроме того, в популяции прослеживается уменьшение встречаемости данного заболевания в популяции. На данную динамику влияет уменьшение контакта резус-отрицательной беременной с резус-положительной кровью:
- позднее наступление первой беременности;
- малое количество родов у женщины;
- тщательный подбор крови при ее переливании;
- снижение сенсибилизации после трансплацентарных кровотечений (послеродовая и дородовая профилактика, терапевтическое использование антирезус-иммуноглобулина при массивном попадании резус-положительной крови плода в кровоток матери).
Соответственно, можно сделать вывод, что при соблюдении основных принципов диагностики, динамического наблюдения и лечения можно достигнуть стопроцентной выживаемости новорожденных с гемолитической болезнью. Но самое главное, что благодаря применению профилактики иммунизации резус-отрицательных женщин путем введения препаратов анти-D-иммуноглобулина, позволит в будущем достичь показателей развитых стран.
К сожалению, вопрос финансирования для решения данной проблемы имеет решающее значение. Так как стоимость препаратов антирезус-иммуноглобулина превышает 5000 рублей. А вводить его необходимо как во время беременности и родов, так и после самопроизвольных выкидышей, медицинских абортов и любых инвазивных манипуляций у несенсибилизированных женщин. Таким образом, сумма, затраченная на ведение одной резус-отрицательной беременной, колеблется в пределах 12740 - 21920 рублей без учета стоимости стационарного лечения.
Система оказания медицинской помощи жителям Самарской области направлена на профилактику нарушений репродуктивного здоровья, снижение инвалидизации и смертности детей, улучшение качества оказания медицинской помощи беременным, роженицам, родильницам и новорожденным, создание условий для рождения желанных детей. Предложенный нами новая программа ведения беременных женщин с резус-отрицательной кровью поможет решить проблему, связанную с необходимостью введения антирезус-иммуноглобулина женщинам.
Дифференциальный и инновационный подход в ведении резус-отрицательных беременных связан с включением в программу их исследований нового метода неинвазивной диагностики резус-фактора плода по крови женщины. В результате этого анализа из крови женщины выделяются участки ДНК плода, и путем ПЦР-амплификации данных ДНК с одновременной гибридизационно-флуоресцентной детекцией, которая производится во время прохождения ПЦР, интерпретируются результаты. Если в крови резус-отрицательной беременной присутствовал RhD-ген, то плод резус-положительный, если данный ген не был обнаружен, то плод резус-отрицательный. Данный метод позволяет избежать инвазивных вмешательств: амниоцентеза и кордоцентеза, с целью определения резус-фактора плода, которые не только инвазивны, но и могут стать причиной различных осложнений. Женщины, чей плод резус-отрицательный смогут спокойно дожидаться рождения ребенка, а тем беременным, чей плод резус-положительный будет уделено пристальное внимание в женской консультации и акушерском стационаре.
Одной из задач данного исследования было определить чувствительность и специфичность применяемого метода. Для этого в исследовании принимало участие 100 беременных резус-отрицательных женщин. Они были разделены на две группы. В контрольную группу входили те женщины, чей супруг был так же резус-отрицательным (20 женщин). В результате исследования были получены следующие данные: чувствительность применяемого метода равна 97%, специфичность равна 95%. А с помощью построения характеристической кривой, доказано, что метод диагностики определения резус-фактора плода по крови резус-отрицательной беременной можно считать высокоинформативным. Таким образом, было доказано, что новые диагностические наборы для идентификации гена резус-фактора (RHD) «ДНК-резус ребенка» производства ООО «Ген-технология» можно рекомендовать для внедрения в медицинскую практику акушерам-гинекологам для ранней неинвазивной диагностики резус-фактора плода по крови беременной женщины.
В проспективном исследовании принимало участие 215 беременных резус-отрицательных женщин. Они были разделены на основную и контрольную группы. В основной группе было 165 женщин. Беременным этой группы в 10-12 недель беременности и в 22-23 недели проводился анализ на определение резус-фактора плода по крови матери. После получения результатов анализа те женщины, чей плод оказался резус-отрицательным велись и родоразрешались как при физиологической беременности. Те женщины, чей плод был резус-положительным сдавали анализы на определение титра резус-антител в крови. Если он был отрицательным в 28 недель беременности и в течение 72 часов после родов им вводился препарат антирезус-иммуноглобулина. Если же женщина была резус-иммунизирована, то в течение беременности следили за нарастанием титра антител, проводились дополнительные УЗИ с доплерометрией средней мозговой артерии, с целью выявления отечной формы ГБП и косвенных признаков заболевания. При нарастании титра антител и при наличии УЗИ признаков ГБП, беременные родоразрешались в 36-38 недель беременности. Схема ведения женщин представлена на рисунке 8.1.
Рисунок 8.1. Схема ведения женщин с резус-отрицательной кровью
Женщины контрольной группы (50) наблюдались в соответствии с приказом Минздрава России № 50 от 10 февраля 2003 года.
Стоит отметить, что статистически достоверных различий в экстрагенитальных заболеваниях, гинекологическом анамнезе у женщин обеих групп не было. Что характерно в характере течения настоящей беременности достоверных различий так же не прослеживалось. В обеих группах процент иммуносенсибилизированных женщин, женщин, чья беременность осложнилась гемолитической болезнью плода, и другими патологиями беременности был сопоставим в обеих группах. Методы родоразрешения, и структура показаний к оперативному родоразрешению так же сопоставимы. А вот в структуре новорожденных с диагнозом ГБН прослеживаются различии. Процент детей с ГБН в контрольной группе выше, чем в основной. При этом различии прослеживаются именно в группе новорожденных с гемолитической болезнью легкой степени. Проанализировав истории родов этих женщин, было обнаружено, что имела место гипердиагностика ГБН, и физиологическая желтуха новорожденного принималась за ГБН. То есть в контрольной группе врач подсознательно был нацелен, зная, что женщина резус-отрицательная, на рождения ребенка с заболеванием или автоматически выставлял данный диагноз. В группе женщин, где проводилось определение резус-фактора плода во время беременности, врач заранее знал резус-фактор будущего ребенка и не спешил с вынесением в диагноз ГБН, а руководствовался фактическим состоянием ребенка.
Интересные данные были получены в результате оценки психологического состояния беременных. В последние годы особое внимание уделяется психологическому состоянию беременной. Очень важно понимать значение психологического спокойствия женщины во время беременности. Именно психологический комфорт, спокойствие за здоровье будущего ребенка, за его безопасность влияет на нормальное течение беременности и является залогом успешных и физиологичных родов. Оценка уровня тревожности осуществлялась по тесту Спилберга-Ханина. Тестирование проводилось во время беременности до проведения анализа на определение резус-фактора плода (10 – 11 недель) и после повторного анализа (около 23 недель беременности) в основной группе, и в такие же сроки в контрольной группе.
В контрольной группе у большинства беременных во время первого тестирования был высоким, во время второго тестирования этот показатель увеличился. Что означало, что по мере увеличения срока беременности беспокойство женщин за своего будущего ребенка увеличивалось. В основной группе видно, что уровень тревожности до проведения первого анализа на определение резус-фактора плода, также как и в контрольной группе высокий. Но, после проведения второго анализа, повторное тестирование показало, что большее число женщин указало на умеренный уровень тревожности. В эту группу вошли все женщины, у которых резус-фактор плода оказался отрицательным. То есть вопрос о возможной патологии у ребенка или возможная сенсибилизация беременных перестал их беспокоить, и они спокойно дожидались родов [17 – 21].
Не менее важное значение играет и экономическая составляющая. В результате подсчета средств, затраченных на ведение женщин в основной группе при условии проведения анализа на определение резус-фактора плода по крови матери, сумма оказалась равной 2 734 740,00 рублей. На ведение такого же количества женщин, но по существующей на сегодняшний день схеме, затраты составили 3 396 480,00 рублей. Если воспользоваться предложенной нами схемой, то денежные затраты на ведение группы из 165 беременных с резус-отрицательной кровью сократятся на 661 740,00 рублей. То есть в среднем на ведение одной женщины из этой группы было затрачено на 4 011,00 рублей меньше. Финансовая выгода для системы здравоохранения очевидна.
С 2012 г. по 2016 г. в лаборатории ГБУЗ «МЦ Династия» проведено более 8000 анализов по неинвазивному определению резус-фактора плода для беременных женщин Самарской области с использованием диагностических тест-систем производства ООО «Ген-технология». Ежегодно проводилась оценка специфичности и чувствительности нового лабораторного метода, данные показатели стабильно показывали высокую специфичность и чувствительность на уровне 98%. С 2016 г. анализ по неинвазивному определению резус-фактора плода по крови беременной был включен в программу ОМС.
Таким образом, предложенная нами схема ведения беременных резус-отрицательных женщин с использованием неинвазивной пренатальной диагностики резус-фактора плода позволяет:
- персонализировано подойти к ведению каждой резус-отрицательной беременной женщины;
- избежать инвазивных процедур (амниоцентез, кордоцентез);
- вводить антирезус-иммуноглобулин тогда, когда это действительно необходимо, в то время, когда он вводится тем женщинам, чей ребенок оказывается резус-отрицательным;
- избежать лишних и ненужных финансовых затрат на ведение резус-отрицательной беременной;
- а также вернуть психологическое спокойствие и уверенность в здоровье будущего ребенка женщине.