Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Николаева Т. В., Сетко Н. П., Полякова В. С., Воронина Л. Г.,
1.2. Характеристика модельного эксперимента и методы идентификации структурно-функциональных изменений в коже и ее придатках
Введенные в эксперимент 80 мышей составили одну контрольную и 7 опытные группы, по 10 животных в каждой. Животные были получены из Питомника лабораторных животных «Столбовая». Карантин продлился 14 дней, в течение которых животные содержались по 10 особей в клетке при постоянном доступе к полноценному питанию и питьевой воде с 12-часовым чередованием дня и ночи. На 15 день содержания животных был начат модельный эксперимент.
В первые 16 дней экспериментального исследования животные четырех опытных групп получали затравку растворами солей тяжелых
металлов, концентрации которых составили в пересчете на металл 10 ПДК (Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. СанПин 2.1.4.1074-01). Учитывая, что тяжелые металлы легче поступают в организм с водой, то последняя была заменена растворами солей тяжелых металлов. Экспериментальные животные I опытной группы в качестве питьевой воды получали водный раствор сульфата цинка 0,1238 г/л (50 мг/л в пересчёте на цинк), II опытной группы – водный раствор сульфата никеля 0,0026 г/л (1 мг/л в пересчёте на никель); III опытной группы – водный раствор бихромата натрия двухосновного 0,001433 г/л (0,5 мг/л в пересчёте на хром); IV опытной группы – водный раствор ацетата свинца (трехводный) 0,00054 г/л (3 мг/л в пересчёте на свинец). Выбор пути введения растворов солей тяжелых металлов определялся тем, что для токсичных металлов энтеральный путь поступления, наряду с ингаляционным, является одним из наиболее значимых [1].
Хелатор железа дефероксамин (Novartis Farma S.p.A., Италия) вводился животным V опытной группы ежедневно внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг [58]. Хелатор меди тетратиомолибдат аммония («Sigma», США) вводился мышам VI опытной группы перорально через зонд в дозе
30 мг/кг [56]. Хелатор цинка N,N,N`,N`-тетракис (2-пиридилметил) этилендиамин (ТПЭН) («Sigma», США) инъецировался внутрибрюшинно животным VII опытной группы ежедневно в дозе 8 мг/кг, при этом в качестве растворителя выступала транспортная среда, состоящая из этанола, глицерина и воды, взятых в соотношении 1:3:6 [22]. Животные контрольной группы получали плацебо.
На 17-й день эксперимента животным всех групп под эфирным наркозом была проведена индукция анагена путем депиляции волос с кожи спины (Paus et al., 1994) восковыми мини-полосками WaxStrips «Beauty formulas» (Drammock International LTD., Великобритания), что привело к удалению всех стержней волос с телогеновыми волосяными фолликулами, обнажая кожу спины однотонного розового цвета.
После индукции анагена регистрировались макроскопические изменения цвета кожи мышей в зоне депиляции, который у используемого вида мышей указывает на стадию фолликула волоса [37].
Животные выводились из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом по 50 % особей из каждой группы на 9-е и 19-е сутки после индукции анагена. На 9-е сутки после депиляции 50 % животных из каждой группы выводились из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Общая длительность эксперимента составила 35 суток.
Материалом для гистологического исследования явились образцы кожи спины, ранее подвергнутой депиляции. Отбор исследуемого материала производился с межлопаточной области, паравертебрально, начиная от линии, соединяющей основания лопаток лабораторных животных. Размер образцов кожи составлял 10×15 мм. Для проведения световой микроскопии образцы кожи мышей после забора помещали в 10 % нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре в течение суток. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин. Гистосрезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином и по Ван-Гизону. Морфологические изменения в образцах кожи экспериментальных животных выявлялись путем сравнения с материалом контрольной группы. Оценка признаков дистрофии волосяных фолликулов дана на основании предложенных M. Maurer (1997) изменений [35], среди которых учитывались внематриксные гранулы меланина (эктопированные в дермальный сосочек и/или перифолликулярную дерму) и аномально раздутые каналы волоса. Оценка пролиферативной активности кератиноцитов покровного эпителия и производных кожи основывалась на изучении характера экспрессии ядерного антигена Ki-67 [3]. Использование Ki-67 в качестве маркера пролиферации обусловлено его экспрессией только делящимися клетками и быстрым распадом, исключающим его накопление и обнаружение в покоящихся клетках [4]. Определение экспрессии белка Ki-67 проведено на 9-е сутки после депиляции во всех опытных и контрольной группе. Для этого использован иммуногистохимический метод с применением кроличьих моноклональных антител к Ki-67 (clone SP6) (Cell marque, США). Визуализацию Ki-67-позитивных клеток производили согласно протоколу фирмы-производителя (Cell marque, США). Ki-67-позитивные клетки определялись по окрашенному в коричневый цвет ядру. Подсчет Ki-67-позитивных клеток и общего количества клеток проводили в 15 полях зрения при увеличении ×600.
Апоптотические клетки выявлялись путем идентификации каспазы-3, являющейся ранним маркером апоптоза, который экспрессируется клетками всех тканей [7]. Выявление экспрессирующих каспазу-3 эпителиальных клеток выполнено с использованием первичных антител Human CPP 32 (caspase-3) Clone JHM62 согласно протоколу фирмы-производителя (Spring BioScience, США). Подсчет клеток проводился не менее чем в 15 полях зрения при увеличении ×600. Каспаза-3-позитивные определялись по темно-коричневой зернистости в ядре и цитоплазме. Оценивались клетки покровного эпителия и эпителиальные клетки волосяных фолликулов – наружной и внутренней оболочек влагалища фолликула волоса, без учета зоны матрикса, где из-за скопления гранул меланина меченые ядра клеток трудно различимы. Для каждого поля зрения рассчитывали индекс пролиферации и индекс апоптоза, которые представляли собой долю позитивно окрашенных клеток к общему количеству клеток, выраженному в процентах [7]. Данные для каждой группы представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки средней (М ± m), и 95 % доверительного интервала (95 % ДИ). Сравнение данных каждой из опытных групп и контрольной, проводилось с помощью критерия Манна – Уитни (1947). В том случае,
если доверительные интервалы для средних значений сравниваемых показателей имели трансгрессию, различия между ними считались статистически незначимыми.
На 19-е сутки после депиляции из эксперимента выводились оставшиеся 50 % мышей из каждой группы. Забор образцов кожи проводился описанным выше способом с подготовкой гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином Майера и эозином и по Ван-Гизону, для изучения на светооптическом уровне. Иммуногистохимический метод в этой серии опытов и в эти сроки не использовался.
Сроки вывода животных из эксперимента обусловлены стадиями цикла волосяных фолликулов. На 9-е сутки после депиляции кожа мышей линии C57BL/6 содержит анагеновые (растущие) волосяные фолликулы, в которых происходят выраженные пролиферативные процессы [42]. На 19-е сутки после депиляции волосяные фолликулы находятся в стадии катагена (переходная фаза), характеризующаяся процессами инволюции волосяного фолликула [37, 42].