Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН
Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,
5.4.2.3.3. Тканевая инженерия суставного хряща с использованием мезенхимальных стволовых клеток
Изучение хондрогенеза стволовых клеток становится все более актуальным для разработки эффективных стратегий дифференциации при получении достаточного количества хондроцитов, необходимых для трансплантации. Из-за обширной дифференцировочной способности стволовых клеток их контролируемая дифференциация в функциональные хондроциты остается реальной проблемой. Разработка эффективных протоколов дифференциации, включающих возможность регулирования хондрогенеза и особенно решение проблемы гипертрофии МСК, становится особенно значимым для клинического применения тканеинженерных решений для суставного хряща, а также для скрининга препаратов для лечения гипертрофического остеоартрита. Функциональная хондрогенная дифференциация и стабильность фенотипа новообразованного хряща являются критическими факторами в клиническом применении стволовых клеток для восстановления хряща.
Имеются данные о том, что ПТГрП действует также в постнатальном суставном хряще (Jiang J., et al., 2008) и поэтому может участвовать в поддержании стабильного суставного фенотипа. Таким образом, ПТГрП способен модулировать созревание и гипертрофию хондроцитов, что позволяет рассматривать этот белок как очень интересную молекулу-кандидата с возможностью для улучшения хондрогенеза МСК. Однако постоянное применение ПТГрП в хондрогенной среде подавляло хондрогенез вместо селективного ингибирования гипертрофических признаков (Mueller M.B., et al., 2013). Сравнительно мало известно о потенциальном эффекте прерывистого применения ПТГрП на хондрогенез in vitro и на хрящевую ткань in vivo. Несколько исследований сообщили об улучшении остеохондрального восстановления посредством активации ПТГ/ПТГрП-рецепторов (Kudo S., et al., 2011; Orth P., et al., 2013).
Kafienah W. et al. (2007) исследовали возможность создания 3-мерного гиалинового хряща с использованием мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга пациентов с остеоартритом тазобедренного сустава. Клетки, полученные от пациентов, высевали на полигликолевые каркасы и дифференцировали с использованием трансформирующего фактора роста β3 в присутствии или отсутствии ПТГрП для регулирования гипертрофии. Использование количественного биохимического анализа и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволило выявить в тканеинженерном хряще, сконструированном из костномозговых мезенхимальных стволовых клеток, обширный синтез протеогликана и коллагена II типа, но только низкий уровень коллагена I типа. Содержание белка было почти идентично содержанию хряща, сконструированного из бычьих носовых хондроцитов. Анализ мРНК коллагена X типа выявил высокий его уровень в хондрогенных конструкциях по сравнению с таковой в недифференцированных костномозговых мезенхимальных стволовых клетках, что указывает на повышенный риск гипертрофии в клетках хрящевой ткани. Однако включение человеческого рекомбинантного ПТГрП в среду дифференцировки в дозе 1 мкМ или 10 мкМ в течение периода культивирования привело к значительному подавлению экспрессии мРНК коллагена X типа и значительному снижению активности щелочной фосфатазы. Было констатировано, что ПТГрП может подавлять ранние маркеры гипертрофии в культуре мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга пациентов с остеоартритом без какого-либо снижения качества инженерного хряща. Авторам удалось впервые продемонстрировать осуществимость тканевой инженерии гиалинового хряща из костномозговых мезенхимальных стволовых клеток успешно создав трехмерный хрящ самого высокого качества. Использование тщательно упорядоченной последовательности сигналов дифференцировки клеток показало возможность генерации гиалинового хряща с использованием аутологичных стволовых клеток для создания относительно зрелых 3-мерных имплантатов хряща для восстановления суставов у пациентов с остеоартритом.
Большой проблемой при использовании МСК для реконструкции суставного хряща является создание клеток, которые устойчивы к гипертрофии и терминальной дифференцировке. Общие протоколы in vitro для хондрогенной дифференцировки МСК успешно индуцируют экспрессию молекул, присущих хрящевой ткани, включая коллаген II типа и аггрекан, и приводят к фенотипу, подобному хондроциту. Однако во время хондрогенной индукции МСК одновременно приобретают гипертрофические свойства. В процессе хондрогенеза in vitro МСК дополнительно имеет место активация экспрессии коллагена I типа и гипертрофии клеток, что подтверждается повышением содержания в них коллагена X типа, MMP13 и активности щелочной фосфатазы. Как следствие, дифференцированные МСК подвергаются минерализации и васкуляризации после эктопической трансплантации в процессе, подобном эндохондральной оссификации (Pelttari K., et al., 2008). В то время как коллаген II типа является основным структурным коллагеном в хрящевом внеклеточном матриксе, МСК, культивируемые в хондрогенных условиях, поддерживают секрецию коллагена I типа, сопровождающуюся повышением регуляции коллагена X типа параллельно с постепенным понижением уровня коллагена IIA1 типа до более поздних стадий, что указывает на то, что они не останавливают исходную программу и подвергаются гипертрофии (Hardingham T.E., et al., 2006).
Изучение развития суставного хряща становится важным поскольку оно обеспечивает лучшее понимание механизмов регенерации при разработке новых терапевтических стратегий для регенерации хряща. В контексте восстановления хряща и биологии развития предложена концепция «реинжиниринга развития» для реставрации суставного хряща, предусматривающая целесообразность реконструирования стадий развития суставного хряща у взрослых поврежденных тканей (Occhetta P., et al., 2016). Молекулярные пути, взаимодействующие в процессе развития хряща, представляют собой сложные, тонко настроенные многоступенчатые процессы, которые еще не полностью выяснены. Попытка повторить эти моменты развития хрящевой ткани показала, что рекапитуляция физиологических пространственно-временных сигналов способствует образованию in vitro фенотипически стабильного человеческого суставного хряща и что зональная организация и устойчивость к гипертрофии возможны в in vitro модели хондрогенеза МСК (Ng J.J., et al., 2017). Исследуя развитие хряща, Fisher M.B. et al. (2014) получили данные, что скорость созревания, а не состояние созревания конструкции, созданной хрящевой тканью, может быть важным фактором для интеграции в хрящ (Fisher M.B., et al., 2014).