Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
7.1. Система гипобиометаболизма, как изоформа архесистемы
Многие ферменты гетерогенны и являются системами сложными, многокомпонентными. Например, удалось разделить пероксидазу хрена на 5 компонентов. Соотношение между этими компонентами варьировало в зависимости от времени года. Примечательно, что весной в комплексе присутствовало не 5, а только 3 компонента. Из батата были изолированы 2 пероксидазы.
Сравнительный электрофоретический анализ в ПААГ показал, что нитратредуктаза, выделенная из растений пшеницы и ячменя, выращенного в условиях Якутии, неоднородна и состоит из 2–3 изоформ. Данные подтверждены в последующем результатами ионообменной хроматографии экстракта фермента на ДЭАЭ-целлюлозе [193].
Полифенолоксидаза гриба Psaliota campestris также оказалась состоящей из двух компонентов, различающихся по способности окислять катехин и креозол. Эти различия связаны с особенностями белковой молекулы каждого из ферментов. Полифенолоксидаза, как пишет В. Джеймс [105], своего рода аварийный фермент, который вступает в действие при расстройстве отдельных звеньев дыхательного фермента. Действительно, при понижении температуры, требовательная к теплу, цитрохромоксидаза заменяется полифенолоксидазой, которая в условиях холода функционирует с большой активностью [245]. Как пишут эти же авторы, в период активного роста клубней картофеля центральное место в их дыхании принадлежит цитохромоксидазе, тогда как после уборки клубней – тирозиназе. У молодых клубней картофеля в августе на долю растворимой полифенолоксидазы приходилось только 3 % от общего количества фермента, а в ноябре – около 80 %.
При температуре, неблагоприятной для дыхания плодов определенного возраста, одновременно с падением интенсивности процесса сильно увеличивается доля анаэробного обмена.
Смену ферментных систем в онтогенезе растений и при неблагоприятных условиях существования, в частности, при низких температурах, можно считать установленной [109, 245, 254]. Конкретных данных о температуре смены ферментных систем в литературе почти нет. Однако известно, что когда многие ферменты активизируются при температурах, близких к 5–4 °С, другие ферменты уже теряют свою функциональную активность. Например, растворимая аденозинтрифосфатаза, которая состоит из идентичных субъединиц, теряет активность при 4 °С и не способна реактивироваться при нагревании [110]. Судя по тому, как многие ключевые физиологические процессы, такие как фотосинтез, дыхание, водообмен, рост и развитие у растений, в частности у теплолюбивых, подавляются температурами, лежащими ниже 5 °С, можно полагать, что потеря активности ферментов при температуре 4 °С и ниже является закономерной. У холодоустойчивых растений одна форма фермента заменяется другой формой фермента, идентичной по составу и функциям, однако отличающейся по температурному оптимуму активности. Примечательные в этом отношении экспериментальные данные мы находим в работе A. Roberts [385, 386]. Он специально исследовал соотношение двух форм инвертазы в связи с закаливанием пшеницы к морозу.
Исследование проводили на 9 разных по морозоустойчивости сортах озимой пшеницы и 3 сортах яровой. В незакаливающих условиях роста при температуре 21 °С все сорта показали значительно меньшую активность формы I инвертазы по сравнению с формой II. Величина соотношения I/II составляла у сортов озимой пшеницы 0,13–0,37, яровой 0,15–0,33. У растений озимой пшеницы, выращиваемых в условиях закаливания (6–4 °С), резко возрастала величина этого соотношения, у наиболее устойчивых сортов она увеличивалась почти в 40 раз, и коэффициент корреляции между морозоустойчивостью и соотношением I и II форм инвертазы был равен 0,934. Для яровой пшеницы изменение было незначительным.
Изменение величины соотношения форм инвертазы в результате закаливания было обусловлено одновременным снижением активности формы II и увеличением активности формы I. Это подтверждает гипотезу о том, что у растений озимой пшеницы в условиях закаливания происходит замещение одной формы инвертазы другой. Подобные же данные по изменению соотношения форм инвертазы листьев морозостойкой пшеницы при выдерживании 4–6 °С были им получены еще раньше.
И.Б. Сухарева, О.В. Петрова [281] использовали в своих опытах биотипы озимой пшеницы сорта «Одесская 51», которые различались между собой по морозоустойчивости. Пятидневные проростки закаливали в камерах при температурах 2 °С и –2 °С. В исходных образцах спектра всех типов были идентичными и имели 8–9 компонентов с пероксидазной активностью. После 7-дневного охлаждения при 2 °С (I фаза закаливания) усилилось общее окрашивание, свидетельствующее о повышении каталитической активности пероксидазы. У проростков биотипов № 2, 3 и 4 появился новый компонент с ОЭП 0,12. Изменилась электрофоретическая подвижность некоторых компонентов: вместо 0,47 и 0,26 появилась средняя зона 0,33–0,37 и новый компонент 0,64–0,68, исчезает зона 0,61. Таким образом, наблюдается перестройка ферментной системы пероксидазы.
После охлаждения при –2 °С (II фаза закаливания), процесс существенно изменяется: если в I фазу закаливания большей активностью характеризовались компоненты 0,002; 0,06; 0,12 и 0,16, то во II фазу – зоны с ОЭП 0,70; 0,75 и 0,83, то есть происходит смена одних ферментов другими, с низкотемпературным функциональным оптимумом. В проростках биотипов № 1, 2 и 3 обнаружено 10 зон, а у биотопа № 4 – 12 зон с пероксидазной активностью. Синтезируются новые формы с новыми свойствами.
Изучение множественных форм каталазы показало, что 5-дневные проростки разных биотипов «Одесской 51» различаются по набору компонентов с каталазной активностью. В спектре каталазы проростков биотипа № 1 обнаружено 3 компонента, № 2–5, 3 и 4 – по 4 компонента. Под действием низкой температуры – в I фазу закаливания количество компонентов у всех биотипов уменьшилось до двух.
Подобно названным выше ферментам меняется и активность изопероксидаз листьев озимой пшеницы в процессе ступенчатого охлаждения. Так, в опытах Т.Л. Тажибаевой [282] изучалась динамика удельной активности катодных и анодных изопероксидаз проростков озимой пшеницы сортов «Мироновская 808» и «Безостая I» при ступенчатом охлаждении в морозильных камерах с 10-часовым искусственным освещением (режим охлаждения – 8–10 °С 1 сут; 3–5 °С 1 сут; 0–2 °С 3 сут; –5...–7 °С 1 сут).
Обнаружено, что по мере ступенчатого охлаждения увеличение активности пероксидазы, происходило за счет возрастания доли катодных изопероксидаз и снижения анодных изоформ фермента. Такая тенденция наиболее четко выявляется для более морозостойкого сорта «Мироновская 808». Полученные результаты позволяют предположить, что катодные изопероксидазы играют ведущую роль в защитных механизмах низкотемпературной адаптации.
Интересно отметить, что такая смена ферментных систем, по-видимому, отмечается и у животных организмов. Например, у форели обнаружено два типа ферментов, отличающихся температурным оптимумом активности («холодный» и «теплый» изоэнзимы). Для рыб, адаптированных к 18 °С, оптимальна температура 10–12 °С, а у особей, адаптированных к 4 °С, этот показатель соответствует 2–5 °С [334]. Как пишет автор, не исключено, что таким же образом осуществляются у организмов сезонные биохимические перестройки.
После закаливания сеянцев белой акации был идентифицирован новый компонент растворимых белков – гликопротеин, обладающий высокой водоудерживающей активностью [349].
По данным З.Н. Брянцевой, А.Н. Новоселовой, О.Е. Серовой [42] относительно невысокая холодовая (днем 6, 7, ночью 0 °С, –2 °С в течение 5–6 сут) или тепловая (33–40 °С) нагрузки вызывают у молодых растений пшеницы торможение роста, снижение накопления биомассы. Вместе с тем в этих условиях стимулировался синтез белка, и содержание его повышалось, резко усиливалась нитратвосстанавливающая активность. Примечательно, что у растений холодового варианта вспышка этой активности отмечалась в период охлаждения, затем шло постепенное ее затухание при нормальной температуре в течение последующих 7–8 дней. Аналогичное усиление активности в результате действия примененных температур показано также для ферментов, связанных с энергообменом клетки (АТФаза, гексокиназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа).
Адаптация растений к морозу в условиях пониженных температур связана с функциональными и структурными перестройками клеток, в основе которых лежат качественные, количественные и модификационные изменения белков [296]. Показано, что параллельно развитию морозостойкости растений происходит не только накопление водорастворимых белков, но и увеличивается их гетерогенность. Методом ингибиторного анализа они установили, что блокировка синтеза белка циклогексимидом на стадии трансляции приводит к приостановке синтеза белка и развития морозостойкости растений. Примечательно, что после завершения процесса закаливания обработка циклогексимидом не оказывает существенного влияния на уровень устойчивости. Другими словами, вновь синтезируемые белки в условиях пониженных температур выполняют функцию, прямо связанную с устойчивостью растений.
При закаливании (5 °С) проростков рапса увеличивалось содержание белка, на 8-й день заметно возрастало содержание фракции с электрофоретической активностью 0,47 и 0,51. Обработка циклогексимидом (50 мкг на растение) значительно снижала уровень белка в листьях и их устойчивость, только в условиях закаливания и, что очень интересно, не изменяла эти показатели при комнатной температуре [138, 365]. Авторы делают вывод, что не все растворимые белки, а только определенные фракции существенны для процесса закаливания к морозу.
По данным [222] повышение устойчивости к низким температурам связано с синтезом определенных цитоплазматических белков, с перестройкой белоксинтезирующей и ферментативной систем озимой пшеницы. При повышении устойчивости происходит замена одних форм ферментов на другие, или изменение их соотношения в сторону увеличения более приспособленных к данной температуре. При низкотемпературной адаптации увеличивается гетерогенность изоформ пероксидазы, малатдегидрогеназы, глютоматдегидрогеназы, и уменьшается гетерогенность изоформ каталазы. Закаливание индуцирует появление двух новых компонентов малатдегидрогеназы и трех – глютаматдегидрогеназы.
Другими исследователями [292] с помощью ингибиторного метода обнаружено, что активные приспособительные реакции растения на действие закаливающих температур, индуцирующих формирование повышенной устойчивости, связаны с перестройкой белоксинтезирующей и энергообеспечивающей систем. Предполагается, что подобная реорганизация систем биосинтеза белка и генерации энергии находится под контролем ДНК ядра (генома) и, возможно, ДНК цитоплазмы (плазмона).
Анализ физико-биохимических изменений в плазмолемме и митохондриальной мембране в период установления состояния покоя и повышения морозоустойчивости (сентябрь-декабрь) у клубней топинамбура показал, что в плазмолемме наблюдается изменение изоформ поли- и гликопептидов, увеличивается активность АТФазы. Показана активизация в холоде и других ферментов, например, аскорбатсвободнорадикальной редуктазы, аскорбатпероксидазы, каталазы и других [377].
В результате работы 2ККС в растениях, очевидно, во время 2-й фазы закаливания синтезируются устойчивые структуры, и растения после закаливания становятся резистентными к промораживанию [297, 268, 369].
В настоящее время Субарктика заселена довольно большим количеством видов высших растений. Активные физиолого-биохимические процессы, рост и развитие их идут в широком диапазоне пониженных температур [70, 114, 125]. У субарктических растений, произрастающих в суровых климатических условиях, где лето очень короткое (июнь-август), часты сильные заморозки в течение лета, а температура мерзлотной почвы не превышает 5–8 °С [247]. Предполагается, что у субарктических растений одновременное функционирование архесистемы жзнедеятельности (AСЖД) и системы гипобиометаболизма (СГБМ), и это позволяет им расти и развиваться относительно быстрыми темпами и успевать дать потомство за короткое арктическое лето.
В.Г. Алексеев [9] длительным воздействием низкой положительной температурой (2–3 °С) на растворы белков субарктических растений получил криоэнзимы, сохраняющие функциональную активность в холоде. Изменения содержания криобелков, обладающих ферментативными свойствами, в тканях арктофилы рыжеватой и пушицы влагалищной коррелируют с изменениями температуры среды произрастания растений.
Между тем, и это естественно, холод подавляет синтез многих белков и активность ферментов. Patterson et. al. [380] изучена активность каталазы в листьях ряда растений при их охлаждении до 0 °С. При этом чувствительных к холоду растений – огурца и томата активность каталазы снижается, в то же время у устойчивых к холоду видов – люцерны, пшеницы, гороха, она идет интенсивно.
В результате закаливания (2–4 °С, 52 дня) 9-дневных проростков озимой и яровой пшеницы на электрофореграмме исчезает полоса, соответствующая белку с очень высоким молекулярным весом [370].
Диссоциацию на субъединицы при охлаждении отмечали в случае глюкозо-6-фосфат-дегидрогенезы эритроцитов, карбамоилфосфатсинтетазы из митохондрий сердца быка. Примечательно, что растворимая аденозинтрифосфатаза, которая состоит из идентичных субъединиц, теряет активность при 4 °С и не способна реактивироваться при нагревании [110].
Широко распространенное и часто оправданное убеждение, что обязательное поддержание низкой температуры (около 0 °С) является непременным условием успеха при выделении и хранении ферментов в настоящее время подвергнуто сомнению, поскольку многие ферменты оказались более стабильными при комнатной температуре, чем в холодной камере [110].
Примеров можно было бы привести еще много, но даже приведенные нами выше данные достаточно ясно показывают, что в организме, в частности растительном, одновременно могут присутствовать несколько изоформ белков, ферментов, ответственных за один и тот же биологический процесс. Одни из них активны при нормальных температурах, а другие могут функционировать только в холоде, то есть происходит соответствующая их смена. Очевидно, система гипобиометаболизма (СГБМ) у пойкилотермных и гетеротермных организмов формируется из изоформ белков, синтезируемых в холоде. Природа очень экономна. В связи с этим вполне можно допустить, что система гипобиометаболизма – СГБМ представляет собой холодоустойчивую изоформу АСЖД – архесистемы жизнедеятельности организмов.
В свете уже имеющихся данных, обсужденная нами выше гипотеза о наличии у холодоустойчивых пойкилотермных и гетеротермных организмов, кроме архесистемы еще дополнительной второй системы – СГБМ, имеющей сродство к льдоподобной воде и полностью вступающей в активное состояние при температурах ниже 4 °С и засухи, поддерживающей жизнеспособность во время гипобиоза, можно считать доказанной.
Таким образом, первые живые организмы были теплолюбами, которые имели архекомплекс систем жизнедеятельности (АСЖД), способные функционировать только в среде свободной воды. Эта система очень консервативна и имеется у всех ныне живущих организмов, то есть не только у теплолюбов, но и у устойчивых к холоду и засухе видов, обеспечивает активную жизнедеятельность, рост, развитие и размножение. Однако в процессе эволюционного развития появились организмы, которые, дополнительно к архекомплексу систем жизнедеятельности (АСЖД), приобрели систему гипобиометаболизма (СГБМ), работающей в среде льдоподобной воды.
Как было показано, в условиях холода и засухи, вода, содержащаяся в клетках и тканях организмов, приобретает льдоподобную структуру или превращается в «жидкий лед». Предковая архесистема жизнедеятельности (АСЖД) в среде «жидкого льда» инактивируется, и ассимиляционные (синтетические) процессы прекращаются, теплолюбы погибают. Однако у холодо – и засухоустойчивых организмов подключается система гипобиометаболизма (СГБМ), представляющая собой изоформу АСЖД и поддерживающая их жизнеспособность, благодаря которой они переходят в состояние гипобиоза. Таким способом пойкилотермные и гетеротермные организмы вполне успешно переживают периодически повторяющиеся неблагоприятные экологические условия.