Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

Иммунофлюоресценция в клинике аутоиммунных буллезных дерматозов. Пособие для врачей

Махнева Н. В., Белецкая Л. В.,

Прямой метод иммунофлюоресценции

Связанные с тканями иммуноглобулины определяют классическим способом прямой иммунофлюоресценции, который осуществляется следующим образом. При взятии биопсии с целью изучения связанного с тканями иммуноглобулина из пораженных или клинически здоровых участков кожи или слизистой оболочки вырезают небольшие кусочки размером 5х5 мм. Ткань биоптата замораживают при низкой температуре (минус 20-60°С). Серийные срезы из замороженной нефиксированной ткани толщиной 5 мкм готовят в криостате (минус 20°С), помещают на предметное стекло, подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) pH 7,0-7,4 в течение 10 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывают люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов основных классов (G, A, M), С3 компонента комплемента и фибрина в течение 30 мин. Затем вновь промывают PBS в течение 10 мин и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляют пара-фенилендиамин. Для контроля одновременно проводят изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, в световом микроскопе.

Связанные с тканями иммуноглобулины и иммунные комплексы, определяемые прямым методом иммунофлюоресценции, обнаруживаются как в участках пораженной кожи, так и в отдаленных ее участках, что свидетельствует о распространенности процесса. Однако необходимо отметить, что в участках с наличием видимых нарушений структуры кожи или слизистой оболочки, т.е. в эпицентре поражений нередко обнаруживают лишь следы фиксированного иммуноглобулина. Это является весомым аргументом для использования биоптатов тканей только клинически непораженной кожи - как удаленных, так и из соседних с поражением участков. Кроме того, с учетом системного поражения и способности кожи элиминировать иммунные комплексы из организма, в случаях локального поражения только в слизистых оболочках полости рта, носа или гениталий, т.е. в местах недоступных для взятия биопсии, могут быть использованы здоровые на вид участки кожи больных. Таким путем удается выявить наличие у больного синдрома иммунных комплексов.