Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Соколова Т А, Котловский Ю В, Дубынина Е В, Ивановская О В, Веселова В К, Кузнецова Е Ю,

1.1. Получение препаратов хромосом

До 1960 года получение качественных препаратов хромосом для проведения цитогенетического анализа представляло существенную проблему, поскольку для этой цели было необходимо исследовать клетки тканей, обладающих высокой пролиферативной активностью, например кроветворной ткани костного мозга. К началу 60-х годов XX столетия усилиями нескольких исследователей был разработан достаточно эффективный метод получения препаратов хромосом из лейкоцитов периферической крови человека [3].

По мере развития цитогенетики арсенал используемых методов непрерывно пополнялся. К настоящему времени, возможно изучение всего хромосомного набора, отдельных хромосом и их участков в клетках практически любых тканей и органов, на любой стадии клеточного цикла, в митозе и мейозе.

В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей in vivo и in vitro различают прямые и непрямые методы получения препаратов хромосом.

• Прямые методы используются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, хорион и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непосредственно из свежеполученного материала после специальной обработки.

• Непрямые методы связаны с предварительным культивированием выделенных из организма клеток в питательной среде in vitro. Наиболее широкое распространение в клинической практике получил метод анализа хромосом из лимфоцитов периферической крови. Циркулирующие в кровяном русле клетки в норме не пролиферируют. В культуральных условиях используют митогены, стимулирующие митотическое деление лимфоцитов.

Существует множество модификаций прямого и непрямого методов приготовления хромосомных препаратов, однако основные этапы получения метафазных пластинок остаются неизменными:

1) использование колхицина (колцемида) – ингибитора образования митотического веретена, который останавливает деление клетки на стадии метафазы;

2) гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хромосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках;

3) фиксация клеток с использованием этанола (метанола) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способствует сохранению структуры хромосом;

4) раскапывание суспензии клеток на предметные стекла;

5) окрашивание хромосомных препаратов.

В зависимости от стадии клеточного цикла, в которой находится исследуемая клеточная популяция возможно проведение следующих цитогенетических исследований:

– анализ отдельных хромосом и их участков в интерфазных ядрах (половой хроматин в ядрах буккального эпителия, оценка анеуплоидии, а так же наличия или отсутствия относительно протяженных участков ДНК в интерфазных ядрах любой ткани методом FISH-анализа);

– профазных хромосом (анализ на стадии пахитены в сперматогенезе);

– прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения);

– метафазных хромосом (традиционный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови, фибробластов кожи, клеток костного мозга, амниотической жидкости);

– стадий анафазы-телофазы (для регистрации специфического воздействия различных мутагенных воздействий).