Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Соколова Т А, Котловский Ю В, Дубынина Е В, Ивановская О В, Веселова В К, Кузнецова Е Ю,

4.2. Алгоритм цитогенетического исследования при различных заболеваниях

1. Острый лимфобластный лейкоз.

Рекомендовано краткосрочное культивирование двух вариантов культур (24 и 48 ч). Для детей постановка прямой культуры, на наш взгляд, весьма желательна. Для флуоресцентной in situ гибридизации предпочтительно использовать клетки из прямой культуры или мазки костного мозга.

Минимальным необходимым объемом исследования, проводимым при В-клеточном остром лимфобластном лейкозе у больных любого возраста, является стандартное кариотипирование и тестирование на наличие химерного гена BCR/ABL методом FISH или «real-time» ПЦР.

У детей при нормальном кариотипе или недостаточном качестве/количестве метафаз, или аномальном кариотипе с комплексными и неспецифическими перестройками желательно исследование методом FISH не только с ДНК-зондом к химерному гену BCR/ABL, но и с ДНК-зондом к химерному гену ETV6/ RANX(AML1) – для выявления острых лимфобластных лейкозов с транслокацией t (12;21), имеющих хороший прогноз, однако пока не выделяемых в отдельный лечебный протокол. Кроме того, ДНК-зонд ETV6/RANX(AML1) позволяет обнаружить довольно редко встречающуюся аномалию – амплификацию гена AML1 – недавно обнаруженный маркер неблагоприятного прогноза, а также предположить наличие гиперплоидного кариотипа.

Выявление перестроек гена MLL методом FISH является дополнительным к кариотипированию и молекулярно-биологическому исследованию, т.к. определяющее значение для прогноза и выбора тактики лечения имеет определение гена-партнера, участвующего в перестройке.

При нормальном кариотипе или отсутствии митозов рекомендуется у детей также применять набор из 4–7 центромерных проб (обычно 7, 4, 10, 17 и 5, 18, 14, 13 или Х на выбор) для выявления гипо- и гипер-плоидии. Так же поступают и при обследовании детей, страдающих острым миелобластным лейкозом, в рамках протокола лечения острых лимфобластных лейкозов Berlin-Frankfurt-Munster (BFM) Study Group. Однако такое исследование является крайне дорогим и трудоемким и может быть проведено только в рамках специальной программы.

При Т-клеточных острых лимфобластных лейкозах значительная часть перестроек имеет субмикроскопический характер. European Leukemia Net рекомендовано применение проб для CDKN2A, SIL/TAL, NUP214/ABL1. Однако это также возможно лишь в специализированных лабораториях в рамках утвержденных протоколов.

Наблюдение за остаточной болезнью при остром лимфобластном лейкозе методом G-полос не проводится. В отдельных случаях показано исследование методом FISH. При Ph-позитивном остром лимфобластном лейкозе мониторинг минимальной остаточной болезни целесообразно проводить методом «real-time» ПЦР.

При рецидиве заболевания достаточно проанализировать 10 метафаз, если обнаружена аномалия, выявленная в дебюте заболевания. При нормальном кариотипе анализируется 30 метафаз. При поздних рецидивах следует учитывать высокую вероятность появления второй опухоли и при отсутствии диагностической перестройки, на наш взгляд, целесообразно исключить перестройки гена MLL и моносомию 7 (в зависимости от предшествующей терапии) как наиболее частые характеристики вторичных лейкозов.

2. Острый миелобластный лейкоз.

Цитогенетическое исследование методом G-полос остается «золотым стандартом» в диагностике острого миелобластного лейкоза, т.к. хромосомные перестройки выявляются в 85-95 % случаев.

Исследуется костный мозг, в отдельных случаях допустимо исследование периферической крови (при циркуляции бластных клеток). При аберрантном кариотипе анализируется 10–20 метафаз, при нормальном кариотипе – 20–25 метафаз.

Время культивирования составляет 24–48 ч. У детей желательна постановка и прямой культуры. При промиелоцитарном лейкозе постановка 48-часовой культуры обязательна.

При подозрении на острый промиелоцитарный лейкоз и нормальном кариотипе или отсутствии митозов показано исследование с ДНК-зондом для выявления химерного гена PML/RARa. Во всех случаях предполагаемого, по данным морфологического и цитохимического исследований, промиелоцитарного лейкоза следует направить материал для исследования методом FISH или «realtime» ПЦР в одну из специализированных лабораторий. При аномальной эозинофилии проводят исследование с ДНК-зондом для выявления inv(16)(p13;q22) или t(16;16)(p13;q22). При бифенотипическом варианте – исследование с ДНК-зондом к химерному гену BCR/ABL. При отсутствии морфологических особенностей и нормальном кариотипе или отсутствии митозов для своевременного выявления группы высокого риска следует провести исследование методом FISH с ДНК-зондами для выявления t(8;21)(q22;q22), перестроек гена MLL, моносомии 7, inv/t(3p21;3q26).

Исследование после индукционной терапии может быть полезным при рефрактерном течении заболевания и при невозможности провести молекулярно-биологическое исследование (например, при моносомиях и трисомиях). Целесообразно в этих случаях исследование методом FISH. В целом наблюдение за минимальной остаточной болезнью цитогенетическими методами не проводится.

В случае рецидива заболевания достаточно проанализировать 10 метафаз, если обнаружена аномалия, выявленная в дебюте заболевания. При нормальном кариотипе анализируется 30 метафаз, при наличии возможности следует провести исследование методом FISH. При поздних рецидивах также следует учитывать высокую вероятность появления второй опухоли.

3. Миелодиспластические синдромы.

При работе с миелодиспластическими синдромами помогает тесное сотрудничество с лечащим врачом и морфологами, что позволяет правильно выбрать ДНК-зонды для дополнительного исследования.

Материал для исследования – всегда костный мозг. Культивирование в течение 24 ч предпочтительнее (с колцемидом/колхицином на ночь или на 0,5–2 ч до фиксации). При нормальном кариотипе анализируется 20 метафаз. При обнаружении аномалии количество анализируемых метафаз следует увеличить до 30 и более.

При нормальном стандартном кариотипировании и отсутствии митозов у взрослых желательно провести исследование методом FISH для выявления делеции хромосомы 5 (del(5q)), моносомии 7/del(7), трисомии 8. У детей – для выявления моносомии 7/del(7) и трисомии 8.

В случае апластической анемии исследование проводится по алгоритму исследования при миелодиспластическом синдроме.

4. Хронический миелолейкоз.

Рекомендовано краткосрочное культивирование двух вариантов культур (24 и 48 ч). Как свидетельствует наш опыт, прямая проба и 24-часовое культивирование дают достаточное количество митозов. В момент первоначальной диагностики возможно исследование как клеток костного мозга, так и периферической крови, однако костный мозг в данном случае предпочтительнее. Для наблюдения за цитогенетическим ответом во время гематологической ремиссии исследуется костный мозг.

FISH-анализ на интерфазных ядрах для выявления химерного гена BCR/ ABL выполняют во всех случаях, т.к. для мониторинга ответа на лечение методом FISH необходимо знать картину распределения сигналов в дебюте заболевания. Случаи с образованием только одного слитного сигнала не подходят для мониторирования методом FISH. Желательно выполнять исследование всем больным с пробой не только к гену BCR/ABL, но и выявляющей делецию 9q34, одного из маркеров резистентности к терапии.

Для определения цитогенетического ответа на лечение основным методом остается стандартное цитогенетическое исследование 25–30 метафаз. При отсутствии митозов анализируется 100–200 ядер методом FISH. В фазе акселерации и бластного криза анализируют 20–25 метафаз, сконцентрировав внимание на поиске дополнительных перестроек.

Для диагностики других миелопролиферативных заболеваний применяют стандартное кариотипирование. Методом FISH или «real-time» ПЦР исключают образование химерного гена BCR/ABL и перестройки гена PDGFRB. Обязательно молекулярно-биологическое исследование для выявления мутаций гена JAK2.

При гиперэозинофильном синдроме помимо кариотипирования выполняют FISH-анализ для выявления перестроек генов PDGFRA и FIP1L1.

Стандартное цитогенетическое исследование по возможности должно проводиться всем больным гематологическими заболеваниями. На какой из молекулярных методов детекции основных диагностических транслокаций – FISH или «real-time» ПЦР – опираться при диагностике, зависит от возможностей и задач клиники. Стремительно развивающиеся молекулярно-биологические методы («real-time» ПЦР, microarrays), позволяющие быстро выявить специфические транслокации и pяд прогностически важных генетических изменений, которые невозможно обнаружить цитогенетическими методами (мутации генов NPM1 и FLT3 при остром миелобластном лейкозе, JAK2 при хронических миелопролиферативных заболеваниях, IgVH статус при хроническом лимфолейкозе), несомненно, несут важную диагностическую информацию, однако по-прежнему не могут заменить стандартное кариотипирование.