Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРИ ОНКОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
Соколова Т А, Котловский Ю В, Дубынина Е В, Ивановская О В, Веселова В К, Кузнецова Е Ю,
5.1. FISH-возможности использования в гематологической клинике
За последнее десятилетие в гематологической цитогенетике произошли принципиально важные изменения, связанные с появлением и быстрым развитием молекулярно-цитогенетических исследований. Развитие молекулярной цитогенетике позволило перейти на новый уровень изучения клональных генетических нарушений, лежащих в основе развития онкогематологических заболеваний.
Предметом анализа в подобном исследовании являются не только метафазы, но и неделящиеся клетки, составляющие абсолютное большинство клеток в любой популяции. Гибридизация происходит со всеми клетками независимо от фазы клеточного цикла. Это означает что для анализа доступны клеточные популяции в целом, что координально изменяет ситуацию по сравнению с классической цитогенетикой. Становятся доступными для анализа те случаи, когда невозможно получить делящиеся клетки. Кроме того, исключается фактор выборочного выхода в митоз определенных популяций клеток, который при анализе метафаз способен порой существенно исказить реальную картину. Возможность анализа всех без исключения клеточных популяций, присутствующих в исследуемом препарате, включая терминально-дифференцированные клетки, делает метод FISH объективным и репрезентативным методом исследования. С введением в практику этого метода стремительно стало нарастать количество исследований по его использованию в клинической цитогенетике, в том числе применительно к онкогематологическим заболеваниям. В настоящее время метод FISH является важнейшем инструментом для цитогенетического анализа клональных нарушений у гематологических больных.
ДНК-зонды, используемые для FISH-исследования представляют собой созданные по специальным технологиям нуклеотидные последовательности ограниченного размера. ДНК-зонд несет «метку», то есть содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом, или связанные с гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром. В основе метода лежит проведение реакции гибридизации между ДНК-зондом и комплементарным ему участком ядерной ДНК препарата, нанесенного на предметное стекло. Связанная с ДНК-зондом метка может быть визуализирована с помощью флуоресцентного микроскопа и позволяет определить место связывания зонда в интерфазном ядре или на метафазной пластинке.
Флуоресцентная гибридизация in situ включает несколько обязательных этапов: денатурации, гибридизации, выявления (детекции) ДНК-зонда.
Цитогенетический препарат фиксируется на предметных стеклах по стандартной цитогенетической методике. Затем ядерная молекула ДНК, существующая в форме двойной полинуклеотидной цепи, подвергается процессу тепловой денатурации. Под действием температуры происходит разрыв водородных связей между комплементарными парами оснований, в результате чего молекула ДНК распадается на две отдельные полинуклеотидные цепи. Для того, чтобы несколько снизить температуру процесса (приблизительно с 95 до 70 °C), денатурацию проводят в растворе формамида, ослабляющего водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями.
Полученные одиночные полинуклеотидные цепи ДНК вступают затем в реакцию гибридизации с предварительно денатурированным в тех же условиях ДНК-зондом. Обязательным условием эффективной гибридизации является многократное избыточное количество зонда по отношению к количеству ядерной ДНК. Только в этом случае зонд может успешно конкурировать за место связывания со второй комплементарной цепью ДНК, присутствующей на стекле. Инкубацию проводят в гибридизационном буфере при 37 °C, время гибридизации зависит от типа используемого зонда. В результате гибридизации вновь образуется двухцепочечная молекула, включившая ДНК-зонд, связанный с комплементарной ему последовательностью нуклеотидов. После этого полученные препараты многократно отмывают для удаления несвязавшегося избытка зонда и предотвращения возможного неспецифического связывания его с другими участками ДНК.
Задачей следующего этапа является идентификация встроенного ДНК-зонда и проведения визуального анализа с помощью флуорисцентного микроскопа. Этот этап зависит от типа используемого ДНК-зонда. В случае, если ДНК-зонд был «помечен» гаптеном, для его детекции применяют иммунохимическое связывание с несущими флуорохром антителами. При использовании ДНК-зондов, уже содержащих в своем составе флуорохром, этого этапа не требуется.
Следующим шагом является контрастное по цвету окрашивание клеточных ядер с помощью ДНК-специфичного флуоресцентного красителя. После этого препарат готов к анализу с помощью флуоресцентного микроскопа, где под воздействием возбуждающего света определенного спектра, молекулы флуорохромов начинают испускать кванты света, длина волны которых зависит от свойств используемого флуорохрома. Анализ флуоресцентных сигналов позволяет получить объективную информацию о состоянии исследуемого хромосомного локуса.
Для анализа флуоресцентных сигналов используют флуоресцентный микроскоп с набором фильтров, соответствующих спектральным характеристикам флуорохромов. Выпускаемые фильтры могут быть одинарными, двойными или тройными. По отношению к FISH-анализу каждый из них имеет свою область применения. Одинарные фильтры предназначены для анализа сигнала только одного флуорохрома. Набор одинарных фильтров, соответствующий спектру применяемых флуорохромов, позволяет последовательно просмотреть и проанализировать все флуоресцентные сигналы. С помощью компьютерного анализа в этом случае можно получить картину, адекватно отображающую распределение сигналов разного цвета в ядре или метафазной пластинке. Однако, непосредственно увидеть разноцветные сигналы в ядре одновременно можно, только используя двойные и тройные фильтры. Двойные фильтры в основном предназначены для работы с одноцветными ДНК-зондами. С их помощью достигается эффект одновременной визуализации флуоресцентного сигнала зонда и контрастно окрашенного ядерного материала, например, зеленый сигнал флуорисцеина на фоне красного ядра, окрашенного PI.Тройной фильтр необходим для работы с двуцветным
ДНК-зондами. Он позволяет одновременно наблюдать красный, зеленый, комбинированный желтый сигналы и контрастно окрашенный в голубой цвет ядерный материал.
ДНК-зонды являются центральным и определяющим звеном при проведении in situ гибридизации. Необходимо всегда помнить, что та или иная хромосомная аномалия может быть выявлена только в том случае, если в распоряжении исследователя имеется соответствующий задаче ДНК-зонд. От типа зонда зависит и система анализа наблюдаемых флуоресцентных сигналов. Поэтому полная информация о специфике используемого зонда является залогом успешной гибридизации и правильной оценки полученных результатов FISH-анализа.
ДНК-зонды бывают двух типов – непрямые и прямые, в зависимости от того, каким образом они помечены. В непрямых ДНК-зондах в синтезированную полинуклеотидную цепь включены нуклеотиды, к которым присоединены гаптены: биотин (витамин H) или дигоксигенин (фитогормон). Эти биологически активные вещества имеют небольшого размера молекулы, обладают термоустойчивостью и легко выдерживают жесткие условия тепловой денатурации ДНК и горячего отмывания препаратов при проведении гибридизации, кроме того они недороги и удобны в работе.
Детекция биотинилированных ДНК-зондов основана на высоком сродстве к биотину белка авидина. Конъюгированный с флуорохромом авидин необратимо связывается с молекулами биотина, наблюдается затем флуоресцентный сигнал позволяет обнаружить ДНК-зонд в клеточном ядре. Меченые дигоксигенином ДНК-зонды инкубиуют с антителами к дигоксигенину, конъюгированными с флуорохромом. Интенсивность флуорисценции непрямых зондов может быть усилена за счет дополнительной инкубации с меченными флуорохромом антителами. Эта возможность усиления флуорисцентного сигнала повышает чувствительность метода при использовании непрямых зондов.
При использовании прямых ДНК-зондов, уже содержащих в своем составе флуорохром, дополнительного инкубирования с антителами естественно не требуется.
В качестве флуорохромов для мечения зондов чаще всего используют зеленый флуоресцеин (FITC), красные родамин и техасский красный (Texas Red). Для визуализации ядерного материала на препараты наносят раствор, содержащий флуорохром, тропный кДНК. В состав раствора входит также вещество, предохраняющее флуорохромы от быстрого истощения.
Основными флуорохромами, используемыми для визуализации клеточных ядер, являются красный пропидиум йодид (PI) и голубой 4.6 диамино-2-фенилиндол (DAPI). Главный принцип при подборе флуорохромов – это принцип цветового контраста.
ДНК-зонды, применяемые в гематологической цитогенетике, можно подразделить на несколько групп.
ДНК-зонды к центромерным участкам хромосом предназначены для идентификации центромерных регионов хромосом и выявления количественных нарушений кариотипа в интерфазных ядрах и метафазах. Эти зонды содержат сравнительно короткие последовательности нуклеотидов, комплементарные многочисленным хромосом-специфическим альфа-сателлитным ДНК-повторам, локализованным в центромерных участках хромосом. Поэтому для зондов этого типа характерна строгая хромосомная специфичность и яркость генерированного флуоресцентного сигнала.
Для выявления диагностически и прогностически значимых количественных хромосомных нарушений в гематологии используют индивидуальные центромерные зонды, например к хромосомам 7,8,12,X/Y. При использовании одного центромерного ДНК-зонда в нормальном интерфазном ядре или метафазе наблюдается два ярких флуоресцентных сигнала. В случае изменения числа копий данной хромосомы наблюдается один (моносомия), три (трисомия) или более сигналов.
При использовании комбинированного ДНК-зонда к хромосомам X/Y центромерные участки половых хромосом помечены флуорохромами генерирующими сигнал разного цвета. Клетки с женским кариотипом в этом случае характеризуются двумя одноцветными сигналами, в клетках с мужским кариотипом наблюдается два сигнала разного цвета.
ДНК-зонды к теломерным участкам хромосом предназначены для выявления делеций и перестроек, затрагивающих концевые участки плечей хромосом. Теломерные ДНК-зонды специфичны для p или q плечей хромосом и комплементарны участку длиной около 300 kb от конца хромосомы. Как правило, зонды к теломерным участкам p и q плечей связаны с разными флуорохромами. Это обстоятельство позволяет проводить детекцию двух различных концевых хромосомных участков на одном цитогенетическом препарате. При проведении анализа концевых делеций с помощью подобных зондов в интерфазных ядрах возникает неопределенность. Отсутствие одного сигнала может свидетельствовать как о делеции концевого участка хромосомы, так и о потере хромосомы. В этом случае удобно одновременно использовать ДНК-зонд к центромерному участку той хромосомы, связанный с флуорохромом другого цвета. В интерфазном ядре, несущем делецию, будет наблюдаться два флуоресцентных сигнала от центромерных участков хромосомы и только один сигнал другого цвета – от теломерного участка.
Локус-специфичные ДНК-зонды составляют еще одну группу зондов. К этому виду относят все ДНК – зонды, которые гибридизуются с уникальными (неповторяющимися) последовательностями ДНК. Среди них заметное место занимают зонды, предназначенные для выявления диагностически и прогностически значимых в гематологии транслокаций, делеций, инверсий.
Проведенные исследования эффективности применения FISH-анализа при различных онкогематологических заболеваний в сравнении с результатами, полученными при кариотипировании, показали, что FISH-анализ позволяет выявлять исследуемые хромосомные абберации достоверно чаще. Во-первых, во всех без исключения случаях(100 %), когда они были обнаружены при стандартном кариотипировании. Во-вторых, в ряде случаев, когда был зарегистрирован нормальный кариотип либо другие хромосомные аномалии, а также в отсутствие делящихся клеток. Кроме того, FISH-анализ позволяет эффективно решить задачу выявления малых клеточных клонов с хромосомными аберрациями, не обнаруженных при стандартном исследовании. Для клинической практики это особенно актуально при детекции минимальной остаточной болезни, выявлении ранних рецидивов, исследовании опухолей с низким митотическим индексом.