Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
§ 1.3. Собственная и несобственная флуоресценция
В основе фотолюминесцентной спектроскопии лежит принцип регистрации индуцированного слабого свечения биологической ткани, которое возникает при поглощении квантов света определенными молекулами, содержащимися в этих тканях.
Из большого числа молекул биологических веществ многие являются природными, или естественными флоурофорами. Тем не менее выделяют и несобственную флуоресценцию ткани, обусловленную свечением различных флуоресцирующих маркеров. Остановимся по подробнее на собственной и несобственной флуоресценции, поскольку данные сведения крайне важны при анализе спектров флуоресценции.
Собственная флуоресценция
При возбуждении ультрафиолетовым светом можно наблюдать флуоресценцию белков. Собственная флуоресценция белков обусловлена аминокислотами триптофан, тирозин, цистеин и цистин [48, 49]. При этом наиболее интенсивно флуоресцирующей аминокислотой является триптофан. Максимум поглощения триптофана приходится на длину волны 280 нм, а максимум испускания расположен около 350 нм. В целом для флуоресценции белков характерно свечение в диапазоне от 300 до 350 нм.
Спектр возбуждения флуоресценции внеклеточных белков коллагена и эластина лежит в интервале от 300 до 400 нм, а спектр флуоресценции данных молекул расположен в диапазоне от 400 до 600 нм с максимумами в близи 400, 430 и 460 нм [50–52]. Сообщается, что флуоресценция коллагена и эластина может быть использована для определения различных типов тканей, например, эпителия и соединительной ткани [52].
В спектральном диапазоне от 440 до 480 нм флуоресцируют восстановленные формы коферментов никотинамидадениндинуклеотида НАДН и никотинамидадениндинуклеотидфосфата НАДФН. НАДН концентрируется, главным образом, в митохондриях, где он окисляется в дыхательной цепи, находясь во внутренней митохондриальной мембране. Различные дисфункции специфических ферментных комплексов дыхательной цепи могут существенно повлиять на соотношение концентраций окисленных и восстановленных форм, и, следовательно, на интенсивность флуоресценции. Поэтому анализ флуоресценции НАДН в современной медицине находит широчайшее применение, например, при определении ишемии [53], новообразований тканей [54, 55], митохондриальных миопатий [56]. Кроме того, было обнаружена зависимость сигнала флуоресценции свободного и связанного с белками НАДН от кислорода [57], что может быть использовано при анализе адаптации организма к изменениям окружающей среды, например, изменений в снабжении кислородом [58]. Флуоресценция НАДФН может также быть также использована для мониторинга потребления кислорода [59], однако она играет существенно меньшую роль в оптической диагностике, чем НАДН.
Флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид также вносят вклад в собственную флуоресценцию клетки и имеют максимум возбуждения вблизи 380 и 450 нм [60], а испускания в области 515 нм. Преимущественно возбуждается окисленная форма молекул флавина, поэтому их свечение может быть также использовано для зондирования функций дыхательной цепи митохондрий.
Молекулам порфирина свойственна флуоресценция в красной области спектра. Молекулы порфирина такие, например, как протопорфирин, копропорфирин, уропорфирин или гематопорфирин участвуют в биосинтезе гемоглобина, миоглобина и цитохромов. Концентрация этих молекул в клетках или тканях обычно очень низка, однако, в случае наличия каких-либо патологий, например, порфирии их уровень может существенно повыситься. Кроме того, уровень протопорфирина может значительно повысится в результате жизнедеятельности бактерий, обитающих внутри участков зубов, пораженных кариесом [38].
Несобственная флуоресценция
Тем не менее, для биологической ткани характерна очень низкая интенсивность собственной флуоресценции, и кроме того, в ряде случаев, регистрации собственной флуоресценции оказывается недостаточным для анализа различных процессов. Поэтому в ряде случаев применяют искусственные флуоресцирующие маркеры, или зонды, которые имеют значительно лучшие фотохимические и фотофизические свойства. Прежде всего можно выделить такие свойства как высокий квантовый выход флуоресценции и высокая фотоустойчивость. Кроме того, желательно, чтобы возбуждение флуоресценции маркеров было в видимом диапазоне, для исключения перекрытия с собственным свечением биологической ткани.
Спектр решаемых задач с помощью флуоресцентных зондов весьма разнообразен. Флуоресцентные зонды позволяют, например, количественно охарактеризовать такие физические свойства мембран, как поверхностный заряд, трансмембранный потенциал, микровязкость, расстояние между липидами и белками, концентрацию воды в мембранах, изменение конформации белков и др. [48].
Использование флуоресцирующих зондов позволяет проводить диагностику многих патологий, в частности раковых заболеваний, иммунных заболеваний, таких как аллергия, токсикозы, атеросклероз.