Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЗАВИСИМОСТИ

Морозова В. С., Габрильянц О. А., Мягкова М. А.,

8.1. Разработка метода «Дианарк»

Метод Дианарк разработан российскими учеными в 1995 г. в Институте физиологически активных веществ РАН (ИФАВ РАН) совместно с Научно-практическим центром наркологии Департамента здравоохранения г. Москвы. Метод позволяет выявить не только наркоманов, но и потребителей наркотиков на ранних стадиях.

Этапу разработки самих тест-системы ИФА антител к наркотическим веществам предшествовало детальное изучение механизмов выработки антител и их свойств. Только опираясь на подобные знания можно создать чувствительные и специфичные тест-системы.

Специфические антитела были выделены из сыворотки больных наркоманией с помощью иммуноаффинной хроматографии. Кратко опишем этот процесс: сыворотка пропускается через хроматографическую колонку, на частицах сорбента которой содержится предполагаемый иммуноген – в данном случае промежуточный метаболит наркотического вещества, образующийся в организме и являющийся индуктором выработки антител. В результате в колонке остается фракция антител, специфически связывающаяся с конкретным антигеном. Ее затем отмывают от частиц колонки, определяют концентрацию антител, их изотип и константу аффинности (т.е. силу связывания антител с данным антигеном).

В результате таких экспериментов нами были выделены и охарактеризованы специфические Ат. Показано их высокое содержание в сыворотке больных наркоманией по сравнению с сывороткой здоровых людей (табл. 14) и высокая константа аффинности (Ка). Определение изотипа специфических антител дало следующие результаты:

– у всех больных опийной наркоманией присутствуют IgM антитела;

– у 50 % из них присутствуют и IgM, и IgG антитела.

Т.е. при выявлении специфических антител необходимо определять Ат как IgM, так и IgG класса.

Таблица 14

Иммунохимические свойства антител, выделенных из сыворотки крови больных опийной наркоманией и доноров

Наиболее сложной задачей фундаментального характера в данном направлении исследований явилось установление химической структуры естественных конъюгированных антигенов, промежуточных метаболитов наркотических веществ, которые являются иммуногенами при выработке специфических антител к наркотическим веществам. Исследования других авторов, пытавшихся в качестве модельных конъюгатов-антигенов использовать простые производные соответствующих наркотических веществ, такие же, как при получении диагностических антител у животных, пришли к выводу о низкой специфичности антител в сыворотках больных наркоманией к таким антигенам (не более 50 %) [1, 2]. Не вызывает сомнения тот факт, что использование антигенов такой структуры не будет обеспечивать специфичного и чувствительного определения антител к наркотическим веществам.

Для установления точной структуры иммуногенов на первом этапе изучались все ферментативные системы, присутствующие в клетках печени и участвующие в метаболизме различных веществ. Все эти ферментативные системы были изучены ин витро, и изучены продукты, образующиеся вследствие взаимодействия ферментов с наркотическими веществами. В результате ин витро были получены и охарактеризованы промежуточные метаболиты, являющие реакционноспособными соединениями и образующие конъюгированные антигены с белками крови. Было установлено, что метаболизм наркотических веществ может идти несколькими путями, в результате образуется несколько видов промежуточных продуктов (рис. 41).

Рис. 41. Метаболизм морфина в организме человека с образованием естественных конъюгированных антигенов – соединений с белками крови

В мире подобных исследований не проводилось, в ИФАВ РАН впервые были изучены структуры данных соединений. Это связано, возможно, с тем, что получение естественных конъюгированных антигенов и изучение их состава – задача сложного фундаментального характера, не сравнимая с рядовой задачей разработки ИФА на высокомолекулярные вещества (возбудители инфекций и пр.). Решение указанной выше задачи находилось на стыке нескольких научных дисциплин: органического синтеза, аналитической химии, медицинской диагностики.

При разработке специфических тест-систем ИФА для выявления антител к вышеуказанным метаболитам были синтезированы конъюгаты, повторяющие по структуре естественные конъюгированные антигены. Схема синтеза такого конъюгата представлена на рис. 42. В данном случае в качестве носителя была использована полимерная матрица – полиметилметакрилат.

Рис. 42. Схема синтеза коньюгата антигена с полимерной матрицей

Полученные соединения были использованы в разработанной схеме ИФА. Процедура проведения ИФА предусматривает выполнение следующих стадий (рис. 43):

1) сорбция антигена на полистирольный планшет (стадия предподготовки планшет; пользователям поставляются уже предподготовленные планшеты);

2) нанесение анализируемых и контрольных образцов сыворот-
ки крови;

3) выявление образовавшихся иммунных комплексов с помощью антивидовых антител с последующим проявлением ферментатив-
ной реакции;

4) измерение оптической плотности (ОП при 450 нм) в ИФА на спектрофотометре с вертикальным лучом;

5) учет результатов. Наличие антител к опиатам в анализируемых образцах выражают в условных единицахА и рассчитывают по формуле:

А = (ОПанал – ОПотр)/ОПотр.

Рис. 43. Схема проведения ИФА антител
к наркотическим веществам методом «Дианарк»

Набор реагентов для иммуноферментного определения антител к наркотическим веществам, состоит из планшета с нанесенным антигеном, положительного и отрицательного контрольного образца, реагента для выявления образовавшихся иммунных комплексов, раствора буфера для приготовления анализируемых образцов, раствора буфера для проведения фермент-субстратного окрашивания, раствор для остановки реакции окрашивания субстрата (рис. 12).

Диагностические системы «Дианарк» разработаны для выявления злоупотребления наркотических веществ различных классов (табл. 15). Каждый набор реагентов является групп-специфичным, т.е. позволяет определить потребителей веществ той или иной группы (опиаты, амфетамины, каннабиноиды и пр.).

Исследования образования антител к наркотическим веществам на крысах показали, что Ат образуются в организме при систематическом употреблении ПАВ уже после 3–5-тикратного употребления и сохраняются в организме длительное время – от 2-х до 5-ти месяцев с момента последнего употребления ПАВ. Наблюдения за людьми, употребляющими наркотики, позволили предположить подобную картину выработки специфических Ат.

Так как антитела к наркотическим веществам появляются в организме на самых ранних сроках злоупотребления ПАВ и формирования зависимости, метод «Дианарк» особенно эффективен при эпизодическом употреблении, когда периодичность приема ПАВ составляет 1–2 недели. Именно при выявлении наркозависимости на ранних стадиях возможно вовремя провести мероприятия для предупреждения развития этой болезни и успешной реабилитации и социальной реинтеграции наркозависимого без потери умственного потенциала, без потери работы.

Таблица 15

Диагностические наборы «ДИАНАРК»

Следует упомянуть, что существуют некоторые свойства специфических антител, которые имеют значение при прохождении обследования в состоянии наркотического опьянения, либо в течение первых 2-х суток с момента приема ПАВ. В этот период в организме повышен уровень ПАВ и их метаболитов, и антитела к ПАВ выполняют свою компенсаторную функцию: они связываются с метаболитами ПАВ в иммунные комплексы, и таким образом уровень свободных антител в кровотоке падает (рис. 44). Поэтому для надёжного выявления потребителей наркотиков, в том числе и в вышеуказанный период, желательно также использовать выявление метаболитов ПАВ в моче методом ИФА [3–5]. Используемый таким образом комплексный подход позволяет наиболее эффективно выявить потребителей наркотиков и наркозависимых на любых стадиях заболевания.

Рис. 44. Уровень антител к наркотическим веществам  их метаболитов во времени послед приема ПАВ

При эпизодическом употреблении ПАВ, когда приемы ПАВ редки, а также в случаях, когда тестирование проводится планово (обследуемые знают о предстоящем тестировании и имеют возможность «подготовиться» к нему), целесообразно использовать только метод «Дианарк», т.к. вероятность нахождения обследуемых в состоянии наркотического опьянения крайне мала.