Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

Вирусные гепатиты. Современные аспекты терапии и фармакоэкономики. Пособие для врачей

Сологуб Т. В., Романцов М. Г., Кетлинская О. С., Петров А. Ю., Комиссаров С. Н., Кремень Н. В., Александрова Л. Н., Суханов Д. С., Ледванов М. Ю., Стукова Н. Ю., Козько В. М., Бондарь А. Е.,

СТРУКТУРА ВИРУСОВ ГЕПАТИТА В И С

Возбудитель ВГ В принадлежит к семейству Hepadnaviridae. Его полный вирион - частица Дейна - имеет ядро с кольцевой двухцепочечной молекулой ДНК, окруженное оболочками. Внешняя оболочка состоит из белков, на которых находится HВsAg с альбуминовым рецептором для прикрепления к гепатоцитам. HBsAg синтезируется в цитоплазме гепатоцитов, часть секретируется в межклеточное пространство и циркулирует в крови.

Внутренняя оболочка представлена HBсAg, в состав которого входит HBeAg. В сыворотке крови выявляют свободный HBeAg, отражающий степень вирусной репликации. В геноме вируса определены последовательности ДНК, ответственные за синтез белков и репликацию вируса, которая идет через промежуточное звено - синтез РНК. Гепатоциты не единственные клетки организма, где происходит синтез НВV. Последовательности ДНК и другие белки вируса идентифицированы в клетках почек, поджелудочной железы, костного мозга, мононуклеарах периферической крови, селезенки и лимфатических узлах. Доказано, что вирус может поражать различные системы и органы, но максимальная экспрессия генов НВV, и прежде всего S-гена, осуществляется в печени. ДНК НВV может также интегрироваться в геном гепатоцита. Идея о существовании интегративного компонента при ВГ В принадлежит С. Хиршману и М.В. Жданову. В процессе инфекции может происходить встраивание всего генома вируса или участка, отвечающего за синтез HBsAg, в клеточные гены, что приводит к синтезу вирусных антигенов. Интегрирование в ДНК генома клетки-хозяина позволяет НВV избегать иммунное распознание.

Сложная схема репродукции НВV определяет повышенную возможность ошибок во вновь синтезированных цепях ДНК. Ошибки в Core-, S-, X-, P-генах приводят к возникновению мутантных форм вируса. Они прежде всего выявляются в зоне pre-core и приводят к блокированию синтеза НВеАg. НВеАg-отрицательный мутант выявляется у больных преимущественно в период элиминации НВеАg, когда отмечается наибольшая активность болезни и, несмотря на наличие анти-HBe, в сыворотке тестируется ДНК HBV. Проявление штаммов HBV с мутациями в оболочечных генах приводит к потере иммунокомпетентными клетками способности обнаруживать HBsAg, что позволяет вирусу персистировать в организме, несмотря на наличие анти-HBs. По мере удлинения течения болезни отмечается увеличение процента содержания мутанта, который может полностью и необратимо заменить «дикий» тип. При достижении уровня 20% общей виремии мутантный штамм может оказывать влияние на ответ терапии ИФН-альфа. Появление pre-core мутантов на фоне лечения указывает на неэффективность дальнейшей терапии.

В настоящее время установлены и другие мутации, возникающие при применении ламивудина, фамцикловира, которые локализуются в Р-гене (в обратной транскриптазе). Возникновение мутантов изменяет мишень для иммунной системы и позволяет вирусу избегать иммунного надзора и элиминации. Это дает основание по-новому оценивать роль мутантных штаммов в патогенезе ВГ В.

Вирус гепатита С (HCV) открыт в 1989 году методом клонирования ДНК-копии вируса, вызывавшего парентеральный гепатит ни А ни В, у инфицированных шимпанзе. Это первый вирус, идентифицированный на основании расшифровки последовательности нуклеотидов задолго до его электронно-микроскопической визуализации. Токсономически он отнесен к семейству Flaviviridae и выделен в отдельный род hepacivirus. Из-за низкого уровня виремии и отсутствия надежных клеточных культур для накопления вируса структура его изучена недостаточно.

Геном HCV представлен однонитевой позитивной линейной молекулой РНК протяженностью около 9400 нуклеотидов. Он содержит два некодирующих региона и одну большую открытую рамку считывания, кодирующую структурные и неструктурные белки. Гены, кодирующие структурные белки, расположены в 5'-области генома, а неструктурные - в 3'-области. К структурным белкам относятся core, Е1 и Е2 белки. Сore-белок является белком нуклеокапсида, он обладает РНК-связывающей активностью, модулирует транскрипцию и трансляцию некоторых клеточных генов и обладает онкогенным потенциалом. Именно с core-белком связывают выраженность прямого цитопатического эффекта НСV. Е1 и Е2 белки - гликопротеины внешней оболочки вируса, высоковариабельны, а их С-концевые части гидрофобны и могут принимать участие во взаимодействии с клеточной мембраной. В структурной зоне кодируется также пептид р7, играющий важную роль в высвобождении вириона из инфицированной клетки.

Неструктурная область вирусного генома кодирует 6 белков - NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. Функции NS2 и NS4 предположительно связывают с клеточной мембраной. Кроме того, белок NS2 является вирусной цинк-зависимой протеиназой и вместе с клеточными пептидазами участвует в аутокаталитическом нарезании самого себя из вирусного полипротеина. Белок NS3 - это вирусная протеиназа, играющая важную роль в процессинге вирусных белков. Белок NS4A действует как эффектор или кофактор для NS3, он регулирует фосфорилирование белка NS5A, который обладает функцией репликазы. Имеется ряд доказательств, что от NS5A зависит резистентность к IFN-α, так как в нем выделен регион, участвующий в ингибировании индуцируемой IFN-α протеинкиназы. Белок NS5B является вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой. Согласно современным представлениям, в инфицированной клетке белки NS4A, NS4B, NS5A и NS5B вместе с белком NS3 ассоциируются в некую структуру, которая играет важную роль в вирусной репликации. Высокая консервативность 5′- и 3′- некодирующих регионов и их роль в трансляции и репликации вируса делают их предпочтительными мишенями в развитии генной терапии (противосмысловых олигонуклеотидов, рибозимов). Дальнейшее изучение структуры ферментов НСV (протеиназы, геликазы, РНК-зависимой РНК-полимеразы) будет способствовать созданию ингибиторов их функций.

HCV так же, как и НВV, обладает тропизмом не только к печени, но и другим тканям и органам. Он способен реплицироваться в клетках иммунной системы, включая моноциты/макрофаги и В-клетки. Показано, что инфицированные лимфоидные клетки могут быть причиной заражения здоровой печени при ее трансплантации больному ВГ С. Внепеченочный резервуар инфекции может служить источником реактивации болезни после прекращения интерферонотерапии, а также играть роль в развитии таких патологических процессов иммунной системы, как лимфома В-клеток, смешанная криоглобулинемия.

Вопрос о роли лимфоцитов в развитии ВГ С активно обсуждается. Результаты Mellor J (1998) указывают, что выявление РНК НСV в мононуклеарах периферической крови варьируют в широких пределах - от 24% до 100% обследованных. По оценке B.Muratori доля инфицированных клеток крови составляет всего 0,2-8,1%. Мнение авторов о количественной оценке РНК НСV в крови при стандартных исследованиях плазмы или сыворотки тоже противоречиво. Одни авторы считают, что количество РНК в сыворотке более точно отражает уровень репликации вируса в печени, поскольку этот показатель представляет вирусные частицы, собранные и активно экспортированные из гепатоцитов. Другие указывают на то, что значительное количество вируса может адсорбироваться на поверхности клеток и входить в состав циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и уходить в осадок, становясь недоступным для определения. При низких титрах внутрипеченочной РНК может наблюдаться активный вирусный гепатит. Несоответствие между количеством выявленных геномной и репликативной форм РНК в печени и уровнем виремии объясняется элиминацией вируса (с помощью специфических антител); поступлением НСV в периферическую кровь не только из печени, но и из других органов и тканей; нарушением процесса высвобождения вируса из клеток печени под действием лекарственных средств.

Одной из важнейших особенностей генома HCV является его выраженная гетерогеность, обусловленная высоким уровнем репродукции и частотой возникновения ошибок при репликации. Скорость продукции вирусных частиц достигает 10¹¹-10¹² в сутки с периодом полужизни вирусных частиц 2,2-7,2ч, тогда как при НВV он составляет 26,4ч. Подверженность мутациям отдельных участков генома различна, наиболее вариабельными являются нуклеотиды внешней оболочки Е2 и Е1. Подобная мультивариантность HCV приводит к постоянному состязанию между образованием новых антигенных вариантов и продукцией нейтрализующих антител, что обеспечивает "ускользание" из-под иммунологического надзора, а также формирование резистентности к противовирусным препаратам и персистенцию HCV.

В литературе обсуждается проблема о том, что у больных, инфицированных НСV генотипом 1b, наблюдалось более тяжелое течение болезни с большей вероятностью развития рецидивов и цирроза печени, а также меньшая эффективность интерферонотерапии. Но однозначного ответа по этому вопросу не получено и требуется дальнейшее его изучение.

При ВГ С не регистрируются интегративные формы. НСV, генетическим материалом является РНК, вирус не способен к интеграции в геном инфицированных гепатоцитов. Однако недавнее открытие комплементарной ДНК РНК-содержащего вируса LCMV позволяет предположить возможность использования данного механизма и НСV.

Установлены географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае, регистрируются преимущественно генотипы 1b, 2а, 2b, тип 1b даже называют "японским". Генотип 1а называют "американским", но он превалирует и в странах Северной Европы, а в Южной Европе заметно возрастает доля генотипа 1b.

В России у взрослых чаще регистрируется генотип 1b (69,6%), далее с убывающей частотой - 3а, 1а, 2а. В Санкт-Петербурге практически с одинаковой частотой выявляются генотипы 3а и 1а (33,3% и 31%), чуть реже - 1b (21,4%) и существенно реже 2а (2,2%). У одного и того же пациента могут выявляться различные генотипы НСV (обычно это больные гемофилией и пациенты, которым многократно проводились переливания крови и кровезаменителей). У больных, инфицированных НСV генотипа 1b, наблюдается тяжелое течение болезни с большей вероятностью развития рецидивов и цирроза печени, а также меньшая эффективность лечения. Однако последние исследования указывают на то, что все выделенные генотипы потенциально способны вызывать тяжелые формы заболевания, а сам по себе генотип не может служить решающим фактором в определении эффективности терапии.

Диагноз устанавливается при наличии серологических маркеров к вирусам гепатитов В и С и при отрицательных результатах определения маркеров вирусного гепатита А (antiHAVIgM) и (antiHDVIgM) с помощью тест-систем различных производителей.

Особенностями диагностики смешанной инфекции (HBV+HCV) является более чем двухкратное снижение частоты обнаружения серологических и молекулярно-генетических маркеров обеих инфекций, как в крови, так и в ткани печени, вследствие взаимного подавляющего влияния вирусов и высокая частота (до 100%) одновременного обнаружения ядерного протеина вируса гепатита В и третьего неструктурного протеина вируса гепатита С в печени иммуногистохимическим методом.

Метод полимеразной цепной реакции (PCR)

В России внедрен способ обнаружения вирусов и бактерий в организме человека - метод полимеразной цепной реакции (PCR), который обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Идея открытия метода PCR принадлежит К. Б. Мюллису, который предложил процесс получения копии генов в неограниченных количествах в одной пробирке и назвал его полимеразной цепной реакцией (1983), с тех пор произошли существенные усовершенствования PCR - технологии.

В настоящее время PCR представляет собой процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть выявлены обычными методами детекции.

Одним из существующих приемуществ PCR является высокая чувствительность; возможности, заложенные в PCR - анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности, показывающей отсутствие перекрестных реакций.

К перечню достоинств PCR - диагностики относятся: предельно высокая чувствительность: от нескольких копий до одного возбудителя в пробе; специфичность метода равна 100% ; для PCR - диагностики пригоден любой материал, в т. ч. и гистологические препараты; метод позволяет контролировать виремию (бактеремию) в процессе лечения; простота использования и возможность автоматизации; результат получают в течение одного рабочего дня.

Таким образом, PCR открывает возможность быстрого синтеза миллионов копий индивидуальной последовательности ДНК, в результате цепной амплификации образуются идентичные фрагменты специфичной ДНК, сразу осуществляется клонирование и/или секвенирование продуктов реакции. Матрицей для PCR - амплификации служит как геномная ДНК, таки ДНК, синтезированная путем обратной транскрипции РНК. Чувствительность метода позволяет обнаружить и амплифицировать единственную молекулу ДНК.