Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Сергеева И. В., Демко И. В.,
Глава 5. ЗАВИСИМОСТЬ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЛИМФОЦИТАХ БОЛЬНЫХ ВНЕБОЛЬНИЧНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ НА ФОНЕ ГРИППА С РАЗЛИЧНЫМИ СТЕПЕНЯМИ ТЯЖЕСТИ
Кровь для выделения лимфоцитов из крови обследуемых для проведения биолюминесцентного анализа забиралась из локтевой вены утром, натощак в стерильные флаконы в объеме 20–25 мл, в которые предварительно вносился 2,7 % раствор антикоагулянта ЭДТА на физиологическом растворе NaCl из расчета 1 мл на 9 мл крови. Выделение лимфоцитов из крови производилось по методу А. Bouym (Boyum A., 1968) на градиенте плотности фиколл-верографина [301].
После разведения крови в 1,5 раза физиологическим раствором NaCl она центрифугировалась 2–3 раза по 5–7 минут при 1000 об/мин; затем отделялась плазма, обогащенная лейкоцитами, которая наслаивалась на 2–3 мл раствора фиколл-верографина с плотностью 1,077 г/мл.
После центрифугирования в течение 30 мин при 1500 об/мин, кольцо лимфоцитов, осевших на фиколл-верографине, собирали, отмывали ресуспендированием в физрастворе NaCl и центрифугированием при 1000 об/мин. В дальнейшем взвесь лимфоцитов вновь ресуспендировали в физрастворе и подсчитывали концентрацию клеток во взвеси в камере Горяева. При контроле морфологического состава взвесей под микроскопом определялась их чистота, которая подтвеждала, что они на 95–97 % состоят из лимфоцитов. Отделяли в стеклянные флаконы от общей взвеси ее объемы, содержащие 0,5–1 млн клеток и замораживали при –18 °С для хранения и последующего проведения исследований – определения в клетках активности ферментов [301].
Исследование показателей внутриклеточного метаболизма лимфоцитов проводили по методике А.А. Савченко и Л.Н. Сунцовой (Савченко А.А., Сунцова Л.Н., 1989) на биолюминометре «БЛМ-8801»,
сконструированного в СКТБ «Наука», (г. Красноярск) с бактериальной люциферазой – ферментативной системой НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза, изготовленной из очищенных методами ионообменной хроматографии и гельфильтрации люциферазы
из Photobacteriит leiogпathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска [301].
Определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназ (НАДМДГ, НАДФМДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ, НАДФГДГ), НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ), а также глутатионредуктазы (ГР).