Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН
Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,
1.1.2. Tuberoinfundibular Peptide-39 (TIP39)
Другой представитель семейства паратгормона-tuberoinfundibular пептид состоящий из 39 аминокислотных остатков (TIP39) был выделен из бычьего гипоталамуса. Его сродство и стимулирующая активность связывания с PTH2R аналогичны активности ПТГ (Usdin T.B. et al., 1995; Usdin T.B. et al., 1999). Молекула TIP39 имеет 3 экзона (John M.R. et al., 2002; Papasani M.R. et al., 2004). В отличие от ПТГ, TIP39
не вызывает заметной активации аденилатциклазы в клетках COS-7, временно трансфицированных либо ПТГ/ПТГрП человека, либо крысы (Usdin et al., 2000), но связывается с ними с умеренной аффинностью (Hoare S.R. et al., 1999; Hoare S.R. et al., 2000a; Sam R.J. et al., 2000; Hoare S.R. et al., 2000b). Поиск гомологии показал, что TIP39 содержит 9 важных функционально консервативных аминокислотных остатков гомологичных с ПТГ и ПТГрП, и большинство из них расположены в средней части молекулы. TIP39 имеет относительно низкий уровень гомологии последовательностей с ПТГ или ПТГрП, но исследования ЯМР высокого разрешения показали, что он имеет аналогичную третичную структуру. Среди всех членов семейства ПТГ уникальные свойства TIP39 связаны с его удаленным положением от других членов в филогенетическом плане и отсутствием «МГД» или любого подобного мотива (Papasani M.R. et al., 2004; John M.R. et al., 2002). Структура гена TIP39 высококонсервативна от костистых рыб до млекопитающих и, как и у ПТГ, имеет три экзона (John M.R. et al., 2002). Уникальность TIP39 может быть результатом его более раннего расхождения с другими членами семейства ПТГ.
TIP39 в основном синтезируется в двух областях головного мозга, подпарафакулярной области таламуса и медиальном паралимническом ядре моста. (Dobolyi A., et al., 2003). Экспрессия TIP39 и его рецептора PTH2R выявлена также в гипоталамусе, а экспериментальные данные свидетельствуют о том, что сигнальная способность TIP39 модулирует ноцицепцию и регуляторную сеть тревоги и депрессии (Usdin T.B. et al., 2000). Недавние сообщения показывают, что TIP39 представляет собой нейроэндокринный гормон, который модулирует несколько аспектов стресс-реакции, а также контролирует температуру тела и участвует в обработке слуховой информации. Нейромодулирующая система TIP39-PTH2R преимущественно участвует в нейроэндокринной модуляции. TIP39 влияет на нейроны содержащие соматостатин и кортикотропин-релизинг гормон (Dobolyi A., et al., 2012). Физиологическая роль системы TIP39-PTH2R еще во многом неизвестна. (Piserchio A. et al., 2000; Jonsson K.B. et al., 2001; John M.R. et al., 2002; Gardella T.J. et al., 1996). Тем не менее, распределение PTH2R и TIP39 в тканях вне центральной нервной системы предполагает другие потенциальные физиологические действия для этого сигнального пути (Usdin T.B, et al., 1996; Usdin T.B, et al., 1999).
Функциональная роль системы TIP39-PTHR2 в образовании эндохондральной кости исследовали Panda D. et al. (2009). Авторы изучали и сравнивали экспрессию TIP39 и PTHR2 в хряще длинных костей мышей, а затем оценили влияние сигнальной системы TIP39/PTHR2 на пролиферацию и функции дифференцировки хондроцитов in vitro, используя линию хондроцитарных клеток CFK2 и изучили механизмы этих эффектов. В длинных костях у новорожденных мышей был зафиксирован сильный сигнал для PTHR2 иммунореактивности в круглых хондроцитах. Экспрессия TIP39 была выявлена в созревающих и гипертрофических хондроцитах, но в то же время практически отсутствовала в круглых или плоских пролиферирующих хондроцитах. Экспрессии рецептора и лиганда было подтверждена дополнительно с помощью ПЦР-амплификации транскриптов из пластин роста новорожденных мышей. Это пространственное распределение лиганда и рецептора резко контрастирует с таковым ПТГрП (выраженное в хондроцитах и перихондриальных клетках на концах развивающихся костей) и его рецептором PTHR1 (выраженное в основном в созревающих хондроцитах), В возрасте 8 недель иммунореактивность PTHR2 и TIP39 была обнаружена в суставных хондроцитах, хотя окрашивание для лиганда было значительно слабее, чем для рецептора. Эти данные свидетельствуют о том, что сигнальная система TIP39/PTHR2 экспрессируется в пластине роста и суставных хондроцитах, что поднимает вопрос о потенциальной функциональности в биологии этих клеток.
Влияние системы TIP39/PTHR2 на морфофункциональное состояние хондроцитов, авторы исследовали, используя стабильно трансфицированные хондроцитарные клетки CFK2, сверхэкспрессирующие PTHR2 (CFK2R клоны). Установлено, что сигналы TIP39/PTH2R уменьшают пролиферацию хондроцитарных клеток CFK2R. Сигнализация TIP39/PTHR2 ингибирует пролиферацию хондроцитов путем ограничения клеток в фазе G0/G1 клеточного цикла. Влияние TIP39 на процесс хондроцитарной дифференциации в клетках CFK2R оценивали по параметрам экспрессии протеогликана, активности щелочной фосфатазы и минерализации. Все три параметра хондроцитарной дифференцировки были уменьшены в клетках, экспрессирующих PTHR2, по сравнению с контрольными клетками. Эти данные показали, что сигнализация TIP39/PTHR2 изменяет дифференциацию, а также пролиферацию хондроцитов. В клетках, обработанных TIP39 заметно снижается экспрессия коллагена типа II, а также наблюдалось менее значительное снижение коллагена типа X, Глубокое снижение уровня транскриптов коллагена типа II, возникающее после передачи сигналов TIP39/PTHR2 было подтверждено ПЦР в реальном времени. Передача сигналов TIP39/PTHR2 также приводила к изменениям в экспрессии белков, модифицирующих хрящевую матрицу (катепсин D и катепсин L), а также экспрессии матричных белков. Белок олигомерной матрицы хряща (Comp), Runx2, фибронектин 1 и, более умеренно, коллаген типа I увеличивался, а фактор роста соединительной ткани (Ctgf) уменьшался в TIP39-обработанных клеток CFK2R.
В PTHR2-экспрессирующих клональных клеточных линиях под влиянием TIP39 продемонстрировано двукратное увеличение уровней мРНК MMP13, что согласуется с эндогенной экспрессией TIP39 в этих клетках. Кроме того, активация рецептора путем добавления TIP39 привело к увеличению 12-кратного в ММР13 транскриптов в этих клетках. В обработанных TIP39 клетках CFK2R уровни основного транскрипционного регулятора хондрогенеза SOX9 были значительно снижены. Это снижение было еще более выраженным после активации PTH2R путем добавления экзогенного TIP39, что свидетельствует о том, что TIP39/PTHR2 сигнальный путь уменьшается Sox9 экспрессию на уровне транскрипции. Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия Sox9 является ключевой мишенью для сигнальной системы TIP39/PTHR2 в хондроцитарных клетках CFK2. В анализируемой работе продемонстрировано, что сайты экспрессии TIP39 и PTHR2 диаметрально противоположны сайтам PTHR1 и ПТГрП. Известно, что сигнализация ПТГрП/ПТГ/ПТГрП-рецептора функционирует при поддержании хондроцитов в пролиферативном состоянии и предотвращает гипертрофию. Результаты цитируемого исследования показали, что, в отличие от ПТГрП/ПТГ/ПТГрП-рецепторной сигнализации, сигнализация TIP39/PTHR2 ингибировала пролиферацию хондроцитов. Известно, что транскрипционная активация SOX9 путем фосфорилирования является одной из основных целей передачи сигналов ПТГрП/ПТГ/ПТГрП-рецепторной системы (Huang W. et al., 2001). Транскрипционное подавление экспрессии Sox9 является медиатором антипролиферативных эффектов сигнальной системы TIP/PTH2R. Учитывая установленную локализацию экспрессии PTHR2 в относительно незрелых хондроцитах in situ и данные in vitro, демонстрирующие антипролиферативные эффекты, авторы сделали вывод, что TIP39, исходящий из созревающих и гипертрофических хондроцитов, действует на PTHR2, локализованный в покоящихся/ранних пролиферирующих хондроцитах, чтобы уменьшить скорость, с которой покоящиеся хондроциты входят в пролиферативную фазу и, таким образом, выступает в качестве противодействующего пути к действиям ПТГрП/ПТГ/ПТГрП-рецепторной сигнализации в пластине роста хрящевой ткани.