Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

Глава 2. СОДЕРЖАНИЕ ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННОГО БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ И ТКАНЯХ ОРГАНИЗМА (Ледванов М.Ю., Курзанов А.Н.)

Несмотря на широкую продукцию ПТГрП в большинстве исследованных тканей и органов у здоровых людей, его концентрация в кровеносном русле еще несколько лет тому назад была ниже предела обнаружения большинства рутинных аналитических тестов (De Miguel F. et al., 1988). Содержание ПТГрП в крови взрослого здорового человека, как правило, очень низкое (< 2,0 пмоль/л) и большая часть эффектов в этот период жизни обеспечивается не гуморальными, а иными механизмами. По данным Straseski J.A., Kushnir M.M. (2016) значительно более высокие концентрации ПТГрП наблюдались у женщин по сравнению с мужчинами. У женщин самые высокие концентрации наблюдались в возрастной группе 21–30 лет, концентрации были минимальными в группе 41–50 лет, а затем постепенно увеличивались с возрастом. Статистически значимые различия в концентрации наблюдались между возрастными группами женщин 18–30 лет и 31–40 лет 18–40 лет и 41–50 лет и 41–50 лет
и 51–84 лет. Примечательно, что статистически значимые более высокие концентрации наблюдались у женщин в постклимактерический период. У мужчин самые низкие концентрации наблюдались в возрасте от 21 до 50 лет. Более низкие концентрации наблюдались в возрастной группе 51–60 лет по сравнению с мужчинами в возрасте 61–81 лет. Более высокие концентрации наблюдались у женщин, чем у мужчин в возрастных группах 21–30 лет и 51–84 лет. В целом, концентрации ПТГП были выше у женщин, чем у мужчин, и были статистически достоверно выше у пожилых людей. Наибольшие концентрации ПГПГ наблюдались у женщин 21–30 лет и старше 51 года, а у мужчин – старше 71 года. Это распределение по полу и возрасту накладывается на многие связанные с возрастом процессы и заболевания, включая остеопороз, и поднимает вопросы, касающиеся участия ПТГрП в нарушениях регуляции кальция, связанных с возрастом. (Straseski J.A., Kushnir M.M., 2016).

Budayr A.A. et al. (1989) исследовали экстрамаммарную роль ПТГрП измеряя его уровни в сыворотке и молоке лактирующих женщин. Уровни ПТГрП опеделенные путем радиоиммунологического анализа в сыворотке крови лактирующих и нелактирующих женщин были неразличимы [4,2 ± 1,8 и 3,6 ± 1,0 пг экв. ПТГрП-(1-34) на мл соответственно]. Этот результат не исключает возможности того, что лактация приводит к небольшому увеличению уровней ПТГрП в сыворотке. Напротив, высокие концентрации иммунореактивного ПТГрП (40 000–75 000 пг экв. ПТГрП-(1-34) на мл) и соответственно высокие концентрации биоактивных ПТГрП были обнаружены в молоке человека, крысы и крупного рогатого скота. Эти концентрации ПТГрП в молоке превышают аналогичный показатель крови в 10000–20000 раз. Данные о наличии ПТГрП в молоке свидетельствуют о возможности того, что этот протеин может иметь важное значение для неонатального гомеостаза кальция. Bucht E. et al. (1992) использовали радиоиммунологический анализ для определения содержания ПТГрП в молоке женщин в различные сроки после родов. В молоке, собранном в течение первых 6 дней после родов, концентрации ПТГрП показали большие межличностные вариации от 0,3 до 13,7 нмоль-экв/л (от 0,5 до 24,4 нг-экв/мл) и увеличивались между 3 и 5 днями после родов.

Было показано, что ПТГрП, присутствует в молоке различных млекопитающих. Концентрации ПТГрП в коровьем, овечьем и человеческом молоке составили в среднем 59,2 ± 18,5; 74,1 ± 35,0 и 36,6 ± 20,7 мкг/л соответственно, в образцах, собранных на разных стадиях лактации (Law F.M. et al., 1991). Было обнаружено, что ПТГрП в молоке млекопитающих существует в двух формах с молекулярными массами 17,5 кДа и 21,5 кДа, что примерно соответствует изоформам ПТГрП (1-108) и (1-141) соответственно. В продольном исследовании, измеряли концентрацию ПТГрП в молоке во время лактации у коров и обнаружили, что она увеличивается с продолжительностью лактации. Эти авторы также изучили взаимосвязь между концентрацией ПТГрП и общим кальцием в коровьем молоке и различиями между этими компонентами в молоке у коров различныых пород. Концентрации ПТГрП положительно коррелировали с общим молочным кальцием Средняя концентрация ПТГрП в молоке коров породы Джерси была значительно выше, чем у коров фризской породы (52,6 ± 5,4 мкг/л по сравнению с 41,0 ± 4,8 мкг/л), Различались также средние концентрации кальция в молоке (30,5 ± 3,0 ммоль/л по сравнению с 26,7 ± 2,7 ммоль/л). Полученные результаты позволили авторам постулировать, что продуцирование ПТГрП молочной железой может быть связано с переносом кальция из крови в молоко. В исследованиях на коровах показано, что ПТГрП экспрессируется в молочной железе во время поздних сроков беременности и впоследствии увеличивается в период лактации, что указывает на то, что ПТГрП участвует в регуляции местного гомеостаза Ca (Wojcik et al., 1998; Onda K. et al., 2006). Самые высокие концентрации ПТГрП обнаруживается в молоке в период лактации, а также в крови беременных и кормящих женщин и у новорожденных (Kovacs C.S. 2014). Сообщалось, что ПТГрП экспрессируется в плаценте и присутствует на высоких системных уровнях у плода, что подтверждает участие этого протеина в стимуляции плацентарного переноса кальция (Simmonds C.S., Kovacs C.S., 2010).

Natsui K. et al. (1994) обнаружили высокое содержание ПТГрП в спинномозговой жидкости человека, которое превышало его концентрацию в плазме крови. ПТГрП спинномозговой жидкости проявлял биологическую активность стимулируя продукцию цАМФ в культивируемых остеобластических клетках.

Ferguson J.E., et al. (1992) исследовали экспрессию ПТГрП в маточно-плацентарных тканях человека. мРНК ПТГрП была идентифицирована в человеческом амнионе, хорионе, плаценте, децидуальной ткани и миометрии. Самая высокая экспрессия мРНК ПТГрП наблюдалась в амнионе, где она была в 10–400 раз больше, чем в других тканях матки. Количество мРНК ПТГрП уменьшилось в амнионе (но не в других тканях) после начала родов. Биоактивность ПТГрП и иммунореактивный ПТГрП в амнионе тесно коррелируют с содержанием мРНК ПТГрП. Амниотическая жидкость содержала ПТГрП в концентрации 21 ± 6 пмоль/л через 16 недель и 41 ± 9 пмоль/л через 38 недель беременности. Эти концентрации равнялись или превышали те, которые были обнаружены в плазме пациентов с гиперкальциемией, вторичной по отношению к ПТГрП. После разрыва плодных мембран мРНК ПТГрП в амнионе уменьшалась на 78 %. Это снижение, по-видимому, было специфичным для мРНК ПТГрП, поскольку мРНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы оставалась неизменной после разрыва мембран. Подобно мРНК ПТГрП, биоактивность ПТГрП и иммунореактивный ПТГрП в амнионе значительно снижались после разрыва мембран. Поскольку ПТГрП является мощным антагонистом сокращения мышечной мускулатуры, снижение ПТГрП после разрыва плодных мембран может играть ключевую роль в начале родов.

Установлено (Dvir R. et al., 1995), что среднее значение концентрации иммунореактивного ПТГрП в амниотической жидкости в середине беременности (21,2 ± 3,7 пмоль/л) и в последующие сроки гестации (19,0 ± 2,7 пмоль/л) Это в 13–16 раз выше, чем уровни, измеренные в плоде (1,6 ± 0,1 пмоль/л) или плазме материнской крови (1,4 ± 0,3 пмоль/л). Равные амниотическим уровни концентрации ПТГрП выявляются в плазме больных с гуморальной гиперкальциемией индуцируемой злокачественной опухолью. Исследования in vitro указывают на три возможных источника ПТГрП в амниотической жидкости: культивируемые клетки амниотической жидкости, клетки, полученные из амниотической мембраны, покрывающей плаценту и основные мезенхимальые клетки плацентарных ворсинок. Добавление в среду культивируемых клеток амниотической жидкости человеческого пролактина, плацентарного лактогена человека или человеческого гормона роста (100 мкг/л) привело к повышению секреции ПТГрП через 24 ч на 43 %; 109 % и 90 %, соответственно. После внесения в культивационную среду инсулиноподобных факторов роста I и II (100 мкг/л), инсулина (100 мкг/л) и эпидермального фактора роста (10 мкг/л) зафиксировано увеличение секреции ПТГрП на 53 %; 46 %; 68 % и 118 % соответственно. Стимуляция секреции ПТГрП эпидермальным фактором роста или плацентарным лактогеном человека была дозозависима. В противоположность этому, кальцитриол и дексаметазон (10 нмоль/л) индуцировали снижение секреции ПТГрП на 32 % и 75 %, соответственно. Эстрадиол, прогестерон, дигидротестостерон и человеческий хорионический гонадотропин не имели никакого влияния на секреции ПТГрП. Эти данные поддерживают идею о том, что ПТГрП может играть физиологическую роль в маточно-плацентарном взаимодействии и демонстрируют, что уровни ПТГрП амниотической жидкости и плазмы крови, взаимосвязанны, а секреция этого белка подвержена гормональной модуляции клетками амниотической жидкости (Dvir R. et al., 1995).

Исследование содержания ПТГрП в образцах амниотической жидкости, неонатальной интратрахеальной жидкости, внутрижелудочной жидкости и первой мочи новорожденных полученных во время кесарева сечения (Sasaki Y. et al., 2000) позволило установать, что уровень ПТГрП в внутритрахеальной жидкости (41,0–19,6 пмоль/л) был значительно выше, чем в амниотической жидкости (22,1–0,8 пмоль/л), неонатальной желудочной жидкости (13,5–2,5 пмоль/л) и в первой моче (0,95–0,6 пмоль/л). Концентрация ПТГрП при этом в плазме венозной и артериальной крови пуповины была равна (1,35–0,2 и 1,63–0,3 пмоль/л), а плазме материнской крови (1,05 ± 0,1 пмоль/л).

Mitchell M.D. et al. (1996) исследовали содержание ПТГрП в амниотической жидкости, полученной амниоцентезом при доношенной беременности, в обычных родах в срок, в досрочных родах при недоношенной 1 неделю беременности, в преждевременных родах, связанных с клиническим хориоамнионитом. Установлено значительное снижение концентрации ПТГрП в амниотической жидкости во время родов в срок. Преждевременные роды не были связаны со значительными изменениями концентрации ПТГрП в амниотической жидкости, хотя наблюдалась тенденция к снижению концентрации этого белка. Амнион и хорион продуцировали измеряемые количества ПТГрП, и темпы секреции были увеличены внесением в культуральную среду IL-1-бета. Децидуальные клетки не продуцировали обнаруживаемые количества ПТГрП. Следовательно, роды в срок связаны с уменьшением концентраций ПТГрП в амниотической жидкости, что может отражать уменьшение продукции белка амнионом, которое, в свою очередь, может играть активную роль в механизме родов.

Изучение влияния различных цитокинов на продукцию ПТГрП и экспрессию мРНК ПТГрП в клетках человеческого амниона.(Ichizuka K. et al., 1999) показало, что добавление интерлейкина-1beta (IL-1beta, 10 нг/мл) и IL-6 (10 нг/мл) в культуральной среде в течение 24 часов приводило к увеличению уровней ПТГрП в 1,5 и 1,6 раза, соответственно. Эффект этих цитокинов был дозозависимым. Напротив, ИЛ-2 (10 нг/мл) и ИЛ-8 (10 нг/мл) не влияли на продукцию ПТГрП из амниотических клеток. Воздействие IL-1beta или IL-6 в течение 6 часов увеличивала экспрессию мРНК ПТГрП в клетках амниона. Стимулирующий эффект IL-1бета снижался антагонистом рецептора IL-1 (IL-1Ra) дозозависимым образом. Результаты этого исследования свидетельствуют об участии воспалительных цитокинов в регуляции продуцирования ПТГрП в клетках человеческого амниона.

Целью исследований Ramirez M.M. et al. (1995), было определение изменений уровней содержания и локализации пептидных фрагментов ПТГрП в плаценте и эмбриональных мембранах, которые могли бы указывать на их биологическую активность и роль в течение гестационного периода и преждевременных родах. Иммунореактивные ПТГрП (1-34) и ПТГрП (67-86) выявлены в амниотических эпителиальных хорионических трофобластах, децидуальных клеткх и плацентарных синцитиотрофобластах. В эндотелиальной оболочке ворсистых капилляров показано присутствие ПТГрП (67-86), но не ПТГрП (1-34). Эти результаты, показывающие дифференциальную локализацию ПТГрП (1-34) и ПТГрП (67-86), предполагают специфическую обработку предшественника ПТГрП в плаценте человека. Более того, изменения в ПТГрП (1-34), но не ПТГрП (67-86), указывают на особую роль этого пептида в фукционировании матки в процессе родов.

У пациентов с гемодиализом уровень ПТГрП в плазме, 4,2 ± 2 пмоль/л, был значительно ниже, чем у здоровых людей, 8,3 ± 1,1 пмоль/л. Связь между содержанием в плазме крови ПТГрП и ПТГ у пациентов с гемодиализом не обнаружена. Пол, специфические методы лечения и диагнозы не влияли на концентрации ПТГрП (Nordholm A. et al., 2014). Иммунологическая идентификация и распределение ПТГрП в нормальных и злокачественных тканях проведенные в исследованиях Kramer S. et al. (1991) продемонстрировали присутствие ПТГрП в экстрактах плоских карцином и нормальных тканей в концентрациях от 7 до 515 нг/мг белка. Иммуногистохимическое окрашивание нормальной ткани человека выявило несколько ПТГрП-содержащих тканей и подтвердило результаты иммуноанализа, что свидетельствует о паракринной роли ПТГрП. Окрашивание наблюдалось также в нескольких неопластических тканях, включая плоскоклеточные карциномы, карциному легкого, карциному мочевого пузыря, остеогенную саркому и аденокарциному толстой кишки.

С момента обнаружения ПТГрП и его гиперкальциемического эффекта у млекопитающих (Moseley J.M. et al., 1987) иммунореактивность для этого белка также была обнаружена в плазме и тканях низшей группы позвоночных животных: безчелюстных (agnatha), пластинчатожаберных (elasmobranchs) и костистых рыб (teleosts) (Akino K. et al., 1998; Danks J.A. et al., 1993; Danks J.A. et al., 1998; Devlin A.J. et al., 1996; Ingleton P.M. et al., 1995; Trivett M.K. et al., 1999). Окончательное подтверждение существования ПТГ-подобных белков у рыб произошло после выделения ДНК функциональных рецепторов ПТГ у рыбок данио рерио (Rubin D.A. et al., 1999; Rubin D.A., Juppner H., 1999) и клонирования ДНК и гена ПТГрП у лучеперых рыб отряда окунеобразных – морского золотистого леща (Sparus auratus) и рыбы фугу семейства иглобрюхих, (pufferfish, Takifugu rubripes) (Flanagan J.A. et al., 2000; Power D.M. et al., 2000).

Уровни ПТГрП в крови у рыб по меньшей мере на один порядок выше, чем у млекопитающих. У рыбы морская собака (dogfish) и липкой акулы (gummyshark) циркулирующие значения ПТГрП составляли ~9 пМ (Ingleton P.M. et al., 1995; Trivett M.K. et al., 2002), а у красного ската была обнаружена средняя концентрация 2,8 пМ (Akino K. et al., 1998), что эквивалентно концентрациям, которые обычно присутствуют при гуморальной гиперкальциемии у людей с злокачественными новообразованиями. Повышенные плазменные уровни ПТГрП у морского леща, европейской камбалы и зимней камбалы (Pleuronectes americanus) в среднем 1–5 нг/мл, что в 200–600 раз выше, чем у здоровых млекопитающих (< 2 пМ) и в 5–15 раз больше, чем у пациентов с гуморальной злокачественной гиперкальциемией (до 80 пМ).

Экспрессия ПТГрП и мРНК ПТГрП у рыб в основном связана с гипофизом, нервной тканью и тканями, имеющими важную роль в ионном обмене. Высокая иммунореактивность ПТГрП выявлена в экстрактах гипофиза, пищевода, почек, жабер, кишечника, кожи, мышц и печени. Значительные уровни ПТГрП выявлены в пищеводе и окружающих тканях, хотя уровни ПТГрП в этих тканях в 30–40 раз ниже, чем в экстрактах гипофиза. У рыб ПТГрП может действовать паракринным и/или аутокринным образом, но также может быть классическим гормоном поскольку высокие уровни ПТГрП, обнаруженные у рыб, предполагают классическую эндокринную роль этого белка, но на сегодняшний день ни один источник его продукции не был однозначно идентифицирован у рыб. Гипофиз при этом может рассматриваться как потенциальный основной источник ПТГрП (Rotllant J. et al., 2003). У пластинчатожаберных, у костистых рыб и млекопитающих, мРНК ПТГрП и экспрессия белка происходят в структурных тканях и транспортном эпителии (Trivett M.K. et al., 1999; Trivett M.K. et al., 2002).

У миноги отличия в локализации ПТГрП отмечались среди индивидуумов на разных этапах жизненного цикла, предполагая, что распределение ПТГрП и, возможно, его роли могут меняться со стадией развития или условиями окружающей среды (Trivett M.K. et al., 2005). У акул и лучеперых рыб ПТГрП-подобная иммунореактивность и мРНК присутствовали в нескольких тканях, включая хондроциты на краю кальцинированного хряща и в пределах некальцинированного хряща в позвонках, что напоминает распределение ПТГрП в раннем эндохондральном формировании кости у млекопитающих (Danks J.A. et al., 1998; Trivett M.K. et al., 1999; Trivett M.K. et al., 2002).

У морского леща обнаружены транскрипты ПТГрП в мышцах, головном мозге, кишечнике, коже, почках, жаберных нитях и гипофизе (Flanagan J.A., et al., 2000). Показано, что уровни экспрессии этого белка в мышцах примерно в 20 раз выше, чем в коже, головном мозге, почках, жабрах или двенадцатиперстной кишке, и примерно в восемь, четыре и в два раза выше, чем в гипофизе, сердце и задней кишке соответственно (Hang X.M. et al., 2005). Гибридизация in situ показала сигнал в эпителиальных клетках задней кишки, некоторых почечных канальцевых клетках и жаберных клетках, богатых митохондриями. В гипофизе экспрессия гена ПТГрП присутствует в клетках pars intermedia заднего гипофиза, окружающих нейрогипофиз, и также проявляется у рыб в некоторых эпителиальных клетках сезонного сенсора (saccus vasculosus) (Flanagan J.A., et al., 2000). Аналогичное распределение наблюдается у рыбы фугу с исключениями, что неэпителиальные опорные клетки гладкой и поперечно-полосатой мышц, матричные клетки эпидермиса и клетки мембраны жаберных нитей также демонстрируют обильную экспрессию гена ПТГрП (Power D.M. et al., 2000).

Было высказано предположение, что это может быть связано с возможным участием ПТГрП в процессе расширения и релаксации органов полости тела, включая три плавательных пузыря, и выворачивание шипов кожи (Brainerd E.L., 1994), используемых этим животным для защиты. Подобная картина экспрессии встречается в клетках гладкой мускулатуры млекопитающих, где ПТГрП выпоняет роль миорелаксанта. В пятнистой зеленой рыбе фугу обнаружена экспрессия ПТГрП в печени, гипофизе, головном мозге, почке, ультрамебрениальной железе и спинной хорде (Canario A.V.M. et al., 2006).

У личинок морского леща транскрипты ПТГрП обнаруживаются в клетках кожи, эпителии кишечника, нейронах центральной нервной системы и красных мышечных клетках (Flanagan J.A. et al., 1999; Power D.M. et al., 1999). Пептид, локализованный иммуногистохимически у этих личинок, был обнаружен в эпителии задних конечностей, медленной красной осевой мышце, кожных и хлоридных клетках, некоторых почечных канальцах, промежуточных клетках гипофиза, сосудистом сплетении, клетках гипоталамуса, и в лейкоцитах (Ingleton P.M. 2002).

Thiede M.A. et al. (1991) исследовали экспрессию мРНК ПТГрП в тканях курицы и показали, что мРНК ПТГрП экспрессируется на разных уровнях в легких, головном мозге, сердце и тканях пищеварительного тракта, включая проэстрикулус (секреторный желудок), желудок и тонкую кишку. В тканях яйцевода взрослых птиц мРНК ПТГрП была обнаружена в отделах перешейка (секреция мембраны) и оболочки (секреция кальция), но не в ткани малюма (секреция альбумина). Во время развития яйцевода высокий уровень мРНК ПТГрП, присутствующий в яйцеводах 12-недельной птицы, указывает на роль ПТГрП в развитии яйцевода. По мере созревания яйцевода относительно высокие уровни мРНК ПТГрП выявляются в дистальных тканях, которые в конечном счете дифференцируются в перешеек и оболочечную железу (матку).

Li H. et al. (1995) обнаружили присутствие мРНК рецептора ПТГрП и сам ПТГрП во всех областях кишечника крысы, во всех популяциях клеток, выделенных из тощей кишки крысы, и в клеточных линиях крысы и человека. Иммунореактивный ПТГрП наблюдался в эпителиальных клетках по всей длине кишечной ворсинки, но не в клетках крипты. Иммунореактивный протеин был также обнаружен в ростовой среде культивируемых кишечных эпителиальных клеток. Полученные этими авторами результаты свидетельствуютют, что гены ПТГрП и его рецептора широко экспрессируются в эпителии кишечника. Экспрессия двух генов в одних и тех же областях кишечника и в одной и той же линии клеток подразумевает местное аутокринное/паракринное действие пептида. Экспрессия пептида в эпителии ворсинок, но не в клетках крипты, указывает на его роль в дифференциации желудочно-кишечных эпителиальных клеток. С использованием флуоресцентной иммуногистохимии проведено исследование распределения рецепторов ПТГ/ПТГрП в тканях желудка морской свинки. Установлено, что ПТГ/ПТГрП-рецепторы экспрессировались в клеточных телах нейронов миоэнтерального сплетения (Ohguchi H. et al., 2017).

Присутствие мРНК как для ПТГрП так и для рецептора ПТГ/ПТГрП было продемонстрировано в ткани лактирующей молочной железы (Wojcik S.F., et al., 1999). Экспрессия ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептора была исследована в очищенных субпопуляциях стромальных, миоэпителиальных и альвеолярных эпителиальных клеток, полученных из лактирующих молочных желез крыс. Экспрессия ПТГрП и мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора была зафиксирована в альвеолярных эпителиальных клетках и стромальных фибробластах. Результаты исследования экспрессии ПТГрП и рецептора ПТГ/ПТГрП свидетельствуют о паракринной или аутокринной функции ПТГрП в альвеолярных эпителиальных клетках и стромальных фибробластах и паракринных эффектах ПТГрП в миоэпителиальных клетках молочной железы крысы во время лактации.