Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

3.3.4. Роль паратгормон-родственного белка в постнатальном развитии скелета

В постнатальном периоде ПТГрП играет важную роль в нормальном формировании костной ткани (Amizuka N. et al., 1996). ПТГрП секретируется хрящевой тканью суставов в ответ на нагрузки и участвует в регуляции состояния суставного хряща (Macica C. et al., 2011). В хрящевой фазе формирования эндохондральной кости хондроциты формируют модель будущей кости. Как часть этого процесса, хондроциты размножаются упорядоченным образом и устанавливают специализированный внеклеточный матрикс. Когда фаза пролиферации заканчивается, хондроциты прогрессируют в конечно дифференцированное состояние, в котором они сначала становятся гипертрофированными и меняют свою программу матричного синтеза (например, от коллагена типа II к коллагену типа X), затем минерализуют свою матрицу и, наконец, подвергаются запрограммированной гибели клеток или апоптозу (Strewler G.J., 2000).

Впоследствии в минерализованный рудимент вторгаются костные клетки, которые резорбируют хрящевые структуры и заменяют их костью. В отсутствие ПТГрП хондроциты не пролиферируют нормально, что приводит к укорочению костей. Их дифференцировка ускоряется, поэтому их внеклеточный матрикс преждевременно минерализуется, и они подвергаются раннему апоптозу (Karaplis A.C. et al., 1994; Amizuka N. et al., 1996; Amling M. et al., 1997). Мутация в гене ПТГрП у мышей, достигнутая посредством гомологичной рекомбинации (Karaplis A.C. et al., 1994) оказалась смертельной в гомозиготном состоянии. Такие мыши не продуцируют ПТГрП и вскоре после рождения умирают от серьезных дефектов развития хряща или хондродисплазии. У мышей, которые сверхэкспрессируют ПТГрП в хряще, созревание хондроцитов сильно задерживается, апоптоз приостанавливается, а в зрелой кости сохраняются островки хондроцитов. Таким образом, результаты обоих подходов с потерей функции (нокаут гена паратгормон-родственного белка) и подходов с повышением функции (целевой избыточной экспрессии белка в хряще) приводят к выводу, что физиологическое действие ПТГрП в хряще, ускоряет рост хрящевых клеток и противодействует их прогрессированию до терминально дифференцированного состояния.

Пролиферативные эффекты ПТГрП определяют размер и форму скелета путем взаимодействия с продуктами других паттерн-генов. Одним из них является ген Ihh, потомок гена дрозофилы, обнаруженный у позвоночных. Этот ген кодирует белок, взаимодействующий с продуктами других генов в процессе создания структуры конечностей и туловища. У позвоночных белок Ihh секретируется прегипертрофными хондроцитами. С помощью своих собственных рецепторов в перихондриальном слое, окружающем развивающуюся кость, Ihh инициирует секрецию ПТГрП, который, в свою очередь, стимулирует пролиферацию хрящевых клеток и предотвращает терминальную дифференциацию этих клеток. (Vortkamp A. et al., 1996; Lanske B. et al., 1996). Рецепторы ПТГрП присутствуют в пролиферирующих хондроцитах и имеют самые высокие уровни в клетках в переходной зоне, которая находится между зонами пролиферации и гипертрофии; На этих участках клетки немного менее зрелы, чем те, которые продуцируют Ihh. В этом месте расположена система, регулирующая направление жизни хондроцита, в которой клетка либо продолжает пролиферировать, либо дифференцироваться и в конце, становится гипертрофированной и готовится минерализовать хрящевую матрицу, тем самым завершая свою работу.

Бета-фактор основного связывания (Cbfβ) контролирует баланс пролиферации и дифференцировки хондроцитов посредством экспрессии Ihh и ингибирования экспрессии рецептора ПТГрП в постнатальном хряще и образовании костей (Tian F., et al., 2014). В этом исследовании показано не только то, что Cbfβ имеет важное значение для пролиферации и дифференцировки хондроцитов для роста и поддержания скелета у постнатальных мышей, но также и то, что он функционирует в повышающей регуляции экспрессии Ihh до пролиферации хондроцитов и дифференциации остеобластов и ингибирования экспрессии ПТГ/ПТГрП-рецептора для усиления дифференцировки хондроцитов. а также комплекс Runx/Cbfβ непосредственно регулирует экспрессию Ihh на уровне транскрипции.

Было высказано предположение, что Ihh может индуцировать смежные перихондриальные клетки для дифференциации в остеобласты (Kronenberg H.M., Chung U., 2001). У Ihh нулевых мутантных мышей наблюдался провал развития остеобластов в эндохондральных костях (Colnot C., et al., 2005). Остеобласты экспрессируют рецепторы для ПТГрП, фактора транскрипции RUNX2 и цитокина суперсемейства факторов некроза опухолей TNFSF11 (или RANKL), которые участвуют в регуляции дифференцировки остеобластов (Komori T., 2011). Deng A. et al. (2017) в экспериментах с использованием клеточной линии мышиного остеобласта MC3T3-E1 у которых нокдаун Ihh в клетках был достигнут путем инфицирования лентивирусом, содержащим последовательности Ihh shRNA показали, что снижение экспрессии Ihh вызвало значительное ингибирование роста клеток и заметно увеличило скорость апоптоза по сравнению с контрольной группой. Кроме того, нокдаун Ihh значительно уменьшал процент клеток в S-фазе, увеличивая процент в фазе G1, указывая на остановку клеточного цикла в фазе G1-S. Экспрессия ПТГрП, RUNX2, остеокальцина, остеопротегерина и TGF-β значительно снижались после нокдауна Ihh в клетках остеобластов. Белки Hhh способствуют рекрутированию и дифференцировке остеобластов путем стимуляции экспрессии и секреции ПТГрП (Jemtland R., et al., 2003.). RUNX2 является транскрипционным фактором, который необходим для дифференциации остеобластов. Показано, что избыточная экспрессия RUNX2 стимулирует созревание хондроцитов, о чем свидетельствует увеличение в отношении активности щелочной фосфатазы, минерализации и коллагенна 10A типа и матричной металлопротеиназы-13, а также путем поддержания экспрессии Ihh, тогда как введение в культуральную среду ПТГрП блокировало экспрессию RUNX2 и его эффект премутации (Iwamoto M. et al., 2003) Утверждается, что ингибирующие эффекты нокдауна Ihh при дифференцировке и генерации кости связаны с сигнальными путями TGF-β/Smad и OPG/RANKL (Deng A. et al., 2017).

Эффекты обратной связи от Ihh отсутствуют у животных, у которых ген ПТГрП был удален. Действие этих двух белков заключается в передаче сигнала от зрелых клеток и определением посредством регуляторной петли обратной связи баланса между пролиферацией и дифференцировкой хондроцитов и тем самым обеспечения упорядоченного линейного рост кости. События, нарушающие обратную связь, приводят к нарушенному образованию кости, что иллюстрируется нарушением архитектуры роста, когда клетки, лишены рецепторов для ПТГрП, (Chung U. et al., 1998). Система также может использоваться для прекращения линейного роста кости, и она может делать это в период полового созревания. Таким образом, ПТГрП эволюционно связан с устойчивой системой контроля развития конечности.

Этот механизм был подтвержден в исследованиях на мышах с целенаправленной аблацией рецептора ПТГ/ПТГрП (Lanske B. et al., 1996). У таких мышей фиксируется высокая частота ранней гибели плода, что указывает на то, что рецептор ПТГ/ПТГрП играет важную роль на ранней стадии развития. Пациенты с редкой хондродисплазией типа Бломстранда, у которых есть мутации рецептора, имеют сходный фенотип. (Zhang P. et al., 1998; Jobert A.S. et al., 1998; Karaplis A.C. et al., 1998). Мутация в гене, кодирующем ПТГ/ПТГрП-рецептор, делают его активным даже в отсутствие лиганда, что приводит к задержке дифференциации хондроцитов. Кроме того, у людей мутация гена рецептора ПТГ/ПТГрП, который конститутивно активирует рецептор без потребности в лиганде, приводит к редкой форме хондродисплазии, называемой болезнью Янсена или метафизарной хондродисплазией при которой имеет место гиперкальциемия и задержка созревания хондроцитов (Schipani E. et al., 1996). У людей с метафизарной хондродисплазией Янсена проявляются нарушения роста (врожденная карликовость с деформацией конечностей, недоразвитием костей лица, брахицефалией, задержкой оссификации эпифизов). Их кости имеют вид структур формировавшихся на фоне избытка ПТГрП, что подтверждается установленными изменениями хрящевых структур у трансгенных мышей высокоэкспрессирующих этот белок (Schipani E. et al., 1997) и является зеркальным отражением нарушений развития скелета, которые являются результатом нокаута гена этого белка.

Ранняя смерть мышей с гомозиготной делецией гена ПТГрП означала, что эффекты дефицита этого белка нельзя изучать в различных тканях, в которых он экспрессируется у взрослых. Однака, был разработан способ предотвращения смерти в неонатальный период. Мыши, гетерозиготные по гену ПТГрП, были скрещены с трансгенными мышами, у которых ПТГрП сверхэкспрессируется в хряще под контролем хрящевого специфического промотора коллагена типа II (Wysolmerski J.J. et al., 1998). Такое скрещивание дает животных, которые имеют гомозиготное делеционное удаление ПТГрП, и, таким образом, имеют дефицит белка везде, кроме хряща, в котором он экспрессируется, обеспечивая тем самым образование эндохондральных костей. Эти так называемые «спасенные» нокаутные мыши выживают в перинатальный период. Они имеют сложные расстройства развития, которые подчеркивают различные постнатальные действия ПТГрП. К ним относятся преждевременное закрытие ростовых пластин (эпифизов), недостаточность развития молочных желез, отсутствие прорезыванияния зубов и аномалии кожи. Такие мыши используются для изучения последствий постнатального дефицита ПТГрП. Констатация того, что пластины роста исчезают в «спасенных» нокаутных мышах, предполагает, что белок играет физиологическую роль в нормальном процессе эпифизарного закрытия. Закрытием эпифизов во время полового созревания заканчивается линейный рост костей и, таким образом, определяется конечный рост человека, что признается прямым следствием пубертатного увеличения секреции эстрогенов у женщин и у мужчин. Возможно, что повышенная продукция эстрогенов индуцирует закрытие ростовых пластинок путем ингибирования системы Ihh и ПТГрП в хряще.

ПТГрП может влиять на костный метаболизм, модулируя действия трансформирующего фактора роста-β посредством уменьшения скорости синтеза остеокальцина, возможно, на уровне транскрипции, а также участвует в стимуляции дифференцировки клеток костной ткани (Weiss S. et al., 2010). Его влияние на костную ткань опосредуется через систему цитокинов и, в том числе, интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли (ФНО-альфа), а также систему остеопротегерина/RANKL. В естественных условиях ПТГрП стимулирует экспрессию остеобластами интерлейкина-6 и фактора ингибирования лейкоза.

ПТГрП играет центральную роль в физиологической регуляции образования кости (Miao D. et al., 2002), способствуя формированию и выживанию остеобластов и, возможно, играет определенную роль в регуляции физиологической резорбции кости за счет повышения образования остеокластов (Fenton A.J. et al., 1991), а также является важным элементом сложной системы минерализации костей (Boileau G. et al., 2001).

У трансгенных мышей с торможением образования ПТГрП отмечено увеличение апоптоза остеобластов и снижение образования остеокластов, что свидетельствует о существенной роли пептида в формировании костной ткани (Miao D. et al., 2005). ПТГрП является также важным физиологическим регулятором массы костной ткани взрослых организмов (Bisello A. et al., 2004). Остеоциты, клетки, находящиеся в костной матрице, экспрессируют как ПТГрП, так и ПТГ/ПТГрП-рецептор. Поскольку этот рецептор в остеоцитах необходим для нормальной резорбции кости, было исследовано, как ПТГрП остеоцитов влияет на скелет.(Ansari N. et al., 2018). Авторы установили, что взрослые мыши с низким содержанием ПТГрП в остеоцитах имеют низкий объем трабекулярной кости и количество остеобластов, но количество остеокластов не было изменено. Кроме того, размер кости был нормальным, но прочность кортикальной кости была нарушена. Таким образом, ПТГрП, продуцируемый остеоцитами, стимулирует формирование кости и прочность костной матрицы, но не требуется для нормального остеокластогенеза. Исследования в культивируемых остеоцитах мышей с нокдауном ПТГрП или его сверхэкспрессией показали, что ПТГрП, секретируемый остеоцитами, регулирует экспрессию генов, вовлеченных в минерализацию матрицы. Авторы также определили, что остеоциты выделяют полноразмерный ПТГрП без каких-либо признаков секреции форм с более низкой молекулярной массой, содержащих N-домен и пришли к выводу, что полноразмерный ПТГрП, продуцируемый остеоцитами, действует как посредством взаимодействия с ПТГ/ПТГрП-рецептором, так и не зависящими от рецепторов паракринными/аутокринными механизмами стимулируя образование костей и модифицируя прочность кортикальной кости взрослых. У мышей с удаленными яичниками инъекции фрагментов ПТГрП индуцировали увеличение образования костной ткани и снижение костной резорбции (De Castro L.F. et al., 2012). Введение ПТГрП здоровым женщинам в постменопаузе привело к очевидному анаболитическому остеотропному эффекту и увеличению кишечной абсорбции кальция (Horwitz M.J. et al., 2010). Глюкокортикоид-индуцированное угнетение экспрессии ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептора в мезенхимальных стволовых клетках человека может быть одним из механизмов стероидиндуцированной потери костной массы (Ahlstrom M. et al., 2009).

Amano K., et al. (2016) продемонстрировали, что передача сигналов Ihh и PTHR1 в мезенхиме конечности необходима для правильной сегментации и последующего образования и роста костей пальцев. Авторы обнаружили, что удаление PTHR1 вызвало симфалангизм при котором первоначальное хрящевое слияние предотвращало формирование эпифизарной формы роста, что приводило к резорбции и замене оставшегося хряща костной тканью, демонстрируя еще одну новую функцию сигнализации PTHR1 при формировании пальцев. Этии результаты показывают, что сигналы Ihh и PTHR1 в мезенхиме конечностей необходимы для правильного развития пальцевых структур, хотя они, по-видимому, используют разные механизмы.