Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН
Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,
3.3.8. Воздействие паратгормон-родственного белка на кожу и волосяные фолликулы
Доказано, что ПТГрП и его мРНК присутствуют в органах с сильно пролиферирующими клетками, и в том числе в волосяных фолликулах и коже (Thomson M. et al., 2003). Все больше доказательств того, что ПТГрП участвует в нормальном росте клеток кожи, влияет на пролиферацию и дифференцировку эпидермиса и волосяного фолликула. ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептор проявляют выраженную кожную экспрессию, могут оказывать важные паракринные и/или аутокриннные регуляторные влияния. Результаты исследований позволили установить, что ПТГрП кожи участвует в регуляции развития и фукционирования эпидермиса и волосяных фолликулов (Holick M.F. et al., 1994; Schilli M.C. et al., 1997; Foley J. et al., 1998). Одним из известных сайтов нормальной экспрессии ПТГрП является эпидермис. Секретируемый эпидермальными кератиноцитами человека ПТГрП представляет собой гликопротеин (Wu T.L. et al., 1991). Предполагается, что ПТГрП высвобождается эпидермальными клетками и мигрирует для перекрестного взаимодействия с дермальными клетками, поскольку эти клетки имеют ПТГ/ПТГрП-рецепторы.
Обнаружено, что классические рецепторы для ПТГрП и ПТГ экспрессируются на человеческих дермальных фибробластах (Pun K.K. et al., 1988), в то время как специфический присутствует на кератиноцитах (Orloff J.J. et al., 1992). Рецептор ПТГрП (PTH1R) обнаружен также на в эмбриональной дерме, где он также экспрессируется на мезенхимальных клетках (Lee K. et al., 1995; Dunbar M.E. et al., 1998). Сообщалось о реакции кератиноцитов на воздействие ПТГрП (Whitfield J.F. et al., 1992; Henderson J.E. et al., 1992; Kaiser S.M. et al., 1992a; Kaiser S.M. et al., 1992b), но классический рецептор ПТГ/ПТГрП 1 типа не был четко идентифицирован в кератиноцитах с использованием гибридизации РНК полноразмерной кДНК. Убедительно продемонстрировано, что ПТГрП является определяющим фактором пролиферации и дифференцировки эпидермальных клеток. (Merendino J.J. et al., 1986; Holick M.F. et al., 1994; Foley J. et al., 1998; Werkmeister J.R. et al., 1993). Его присутствие было показано в кератиноцитах плода человека (Moseley J.M. et al., 1991) и в эпителиальных клетках развивающихся волосяных фолликулов крысы (Lee K. et al., 1995). Иммуногистологическими исследованиями продемонстрировано наличие ПТГрП в развивающихся придатках кожи (Campos R.V. et al., 1991).
Используя ДНК-зонд для ПТГ/ПТГрП-рецептора, Urena P. et al., (1993) продемонстрировали транскрипты этого рецептора во многих неклассических органах-мишенях ПТГ включая кожу. Показано, что эффектам ПТГрП в кератиноцитах противодействует ПТГрП (7-34), являющийся антагонистом рецептора ПТГ/ПТГрП, который блокирует этот рецептор (Holick M.F. et al., 1994). В других работах были приведены данные о гомологии между рецептором ПТГрП, выявленным в коже крысы (Urena P. et al., 1993) и в клетках плоскоклеточной карциномы человека (Orloff J.J. et al., 1995). Активация гена в эпидермальных кератиноцитах, вероятно, объясняет частоту гиперкальциемии, индуцированной ПТГрП у пациентов с плоскоклеточными карциномами, которые возникают из этого типа клеток. ПТГрП высоко экспрессируется в коже и обладает способностью подавлять пролиферацию эпидермиса, оказывая влияние на процесс дифференциации кератиноцитов (Werkmeister J.R. et al., 1993; Foley J. et al., 1998; Henderson J.E. et al., 1992; Wysolmerski J.J. et al., 1994). Показано, что пептид человека ПТГрП (1-34) и ПТГ человека (1-34) ингибируют пролиферацию и индуцируют терминальную дифференцировку культивируемых кератиноцитов человека (Milstone L.M., 1988).
Введение in vivo антагонистов или агонистов ПТГ/ПТГрП-рецепторов индуцируют у мышей соответственно ингибирование или стимуляцию эпидермальной пролиферации, (Holick M.F. et al., 1994; Holick M.F. et al., 1996; Schilli M.C. et al., 1997). Внесение ПТГрП в культуральную среду клеточной линии иммортализованных кератиноцитов человека вызывало значительное увеличение включения [3H] тимидина, а в культуре неонатальных кератиноцитах, обладающих высоким потенциалом роста, низкие концентрации ПТГрП увеличивали содержание ДНК и скорость пролиферации после 24-часовой инкубации. Эти эффекты нейтрализуются добавлением двух различных антител против рецептора ПТГрП крыс или его антагонистом ПТГрП (7-34).
Эпидермальный фактор роста может усиливать образование ПТГрП в эпидермисе (Cho Y.M. et al., 2004). Уровень экспрессии ПТГрП, по-видимому, контролирует размер пролиферативного пула базальных кератиноцитов, из которого кератиноциты выходят на терминальную дифференцировку, кератинизацию и апоптоз. Этот пул увеличивается, когда ПТГрП сверхэкспрессируется в коже, но уменьшается у «спасенных» нокаутных мышей с обратным увеличением гранулярных клеток, которые вошли в путь дифференцировки. Эти данные позволяют предположить, что после рождения ПТГрП регулирует движение эпидермальных клеток у мышей во многом таким же образом, как и при эндохондральной оссификации в пренатальном периоде. ПТГрП играет роль в регулировании скорости дифференцировки базальных кератиноцитов, развития сальных желез и структуры дермы в коже взрослой мыши. Однако это регулирование может иметь более важное значение для процесса старения, чем для развития эпидермиса (Foley J. et al., 1998). ПТГрП также играет критическую роль в развитии эпидермального, аднексального и дермального слоев кожи. Интересно, что картина фенотипической аномалии, выявленной у мышей с ПТГрП-нокаутом, напоминают проявления наблюдаемые при эктодермальной дисплазии человека, включающей группу из более чем 150 клинически различающихся наследственных нарушений, характеризующихся дефектами кожи, волос, ногтей, сальных желез и зубов (Freire-Maia N., Pinheiro M., 1984).
Kaiser S.M. et al. (1992), исследовали роль ПТГрП в качестве потенциального модулятора роста клеток с использованием антисмысловой РНК-технологии для ингибирования продуцирования эндогенного ПТГрП в клеточной линии кератиноцитов человека. Изучение влияния ингибирования продукции ПТРП на рост клеток продемонстрировало уменьшение времени удвоения и увеличение включения [3H] тимидина. Анализ клеточного цикла показал увеличение доли популяции клеток в S-фазе. Полученные данные указывают на то, что эндогенный ПТГрП действует в этой модели как эффективный ингибитор роста кератиноцитов и что это действие происходит, по крайней мере частично, за счет уменьшения проникновения в S-фазу клеточного цикла.
Взаимосвязь экспрессии ПТГрП и ее субклеточной локализации с развитием клеточного цикла в клеточной линии кератиноцитов человека, которая продуцирует ПТГрП, исследовали Lam M.H. et al. (1997). мРНК ПТГрП и иммунореактивный ПТГрП оценивали в асинхронных делящихся клетках и в клетках, блокированных на фазах G1 или G2 + M клеточного цикла. Экспрессия ПТГрП была наибольшей в фазе активного деления клеток, когда клетки находились в S и G2 + M фазах клеточного цикла и были самыми низкими в покоящихся клетках G1. Кроме того, ПТГрП локализовался в ядре в покоящихся клетках, но перераспределялся в цитоплазму, когда клетки активно делились. В совокупности эти результаты подтверждают роль ПТГрП в делении клеток в линии кератиноцитов. В асинхронно растущих клетках экспрессия ПТГрП снижалась по мере того, как клетки становились слитыми в то время, когда клеточный рост ингибировался и клетки начали дифференцироваться. Митогенная стимуляция клеток в клеточной линии кератиноцитов человека приводила к быстрому увеличению экспрессии мРНК ПТГрП, но она зависела от того, что клетки находятся в фазе G1 клеточного цикла. Результаты этого исследования показывают, что ПТГрП может участвовать в реализации двух процессов в клеточном цикле: один из них имеет место в фазе G1 в ответ на воздействие митогена, а второй происходит при делении клеток, когда экспрессия ПТГрП высока и переносится из ядрышка в цитоплазму.
В исследованиях Sharpe G.R. et al (1998) было установлено, какие изоформы мРНК ПТГрП экспрессируются кератиноцитами. Были обнаружены транскрипты всех трех изоформ ПТГрП (139, 141 и 173 аминокислот). Изучение влияния 1,25 (OH) 2D3 на экспрессию мРНК ПТГрП и продукцию белка в культивируемых кератиноцитах человека показало, что кератиноциты продуцируют избыточный ПТГрП. Установлено, модулирующее действие 1,25 (OH) 2D3 на секрецию ПТГрП, что указывает на его физиологическую роль.
Исследование характеристики экспрессии рецептора ПТГрП в кератиноцитах крысы было проведено Errazahi A., et al. (2003). Авторы изучали экспрессию и функциональность рецепторов ПТГрП в свежеизолированных кератиноцитах из кожи новорожденных крыс, которые в модели ex vivo представляет собой ближайшую нормальную физиологическую стадию эпидермиса. С использованием метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проанализировали наличие РНК рецептора ПТГрП в свежеизолированных кератиноцитах новорожденных крыс. Присутствие ПТГ/ПТГрП-рецептора также было обнаружено с помощью иммуногистохимии и иммуноцитохимии с использованием крысиных антител против этого рецептора. Кроме того, изучили функциональность ПТГ/ПТГрП-рецептора, оценив эффекты ПТГрП (1-34) на пролиферацию кератиноцитов в присутствии или в отсутствие его антагониста ПТГрП (7-34) или антителк этому рецептору (Cataisson C. et al., 2000). Иммуногистохимически исследовали наличие ПТГ/ПТГРП-рецептора в кератиноцитах с использованием антитела, которое распознает внеклеточный домен этого рецептора (Watson P.H. et al., 2000). В срезах эпидермиса ПТГ/ПТГрП-рецептор локализовался в базальных и крупных супрабазальных кератиноцитах и в клетках, инвагинированных в дерме вдоль волосяного фолликула. Локализация выявленного рецептора была мембранной, цитоплазматической или ядерной. Иммунореактивность к ПТГрП-рецептору 1 типа выявлялась также в фибробластах дермы, в слоях эпидермиса, в эпидермальных клетках, растущих глубже в дерме, и в миофибробластах. Иммуногистохимия проводилась также для изучения локализации экспрессии ПТГрП в эпидермисе и мазках свежевыделенных кератиноцитов. В эпидермальных срезах положительное окрашивание наблюдалось главным образом в зародышевых клетках остистого слоя и в сплющенных клетках верхних слоев, как описано во взрослом эпидермисе (Hayman J.A. et al., 1989; Blomme E.A.G. et al., 1998). Окрашивание было цитоплазматическим, а также обнаружено в ядрышке. В мазках распределение ПТГрП было цитоплазматическим, а в некоторых случаях и ядерным.
Авторы показали с помощью ОТ-ПЦР, секвенирования, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии, что свежеизолированные кератиноциты новорожденных крыс экспрессируют функциональный рецептор ПТГрП, который идентичен классическому рецептору ПТГ/ПТГрП 1типа и опосредует действие ПТГрП на эти клетки. Чтобы определить, является ли ПТГ/ПТГрП рецептор кератиноцитов функциональным, были изучены эффекты экзогенного ПТГрП (1-34) на клеточную пролиферацию. Таким образом, эндогенное действие ПТГрП на скорость пролиферации не может быть исключено, поскольку свежевыделенные кератиноциты экспрессируют мРНК и белок ПТГрП. Функциональность ПТГ/ПТГрП-рецептора в кератиноцитах была подтверждена исследованиями, в которых антагонист этого рецептора ПТГрП (7-34) блокировал действие ПТГрП на пролиферацию клеток. Эти данные свидетельствуют, что эпидермис новорожденных крыс и кератиноциты экспрессируют функциональные рецепторы ПТГрП, которые идентичны рецептору ПТГ/ПТГрП 1 типа и взаимодействуют с ПТГрП (1-34).
В той же лаборатории выполнено исследование участия внутриклеточных сигнальных путей в реализации эффектов различных пептидных доменов ПТГрП: N-концевого (1-34), средней области (67-89) и C-концевого (107-139), а также возможную модуляцию ПТГрП и его рецепторных мРНК- витамином D (Errazahi A. et al., 2004). Дермальные фибробласты как и свежевыделенные кератиноциты экспрессировали как ПТГрП, так и мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора и реагировали на различные фрагменты ПТГрП. Под влиянием ПТГрП (1-34) увеличивались как клеточный цАМФ, так и [Ca (2+)] i в кератиноцитах и в фибробластах. Напротив, ПТГрП (107-139) увеличивал [Ca (2+)] i, но не cAMP в этих двух типах клеток. ПТГрП (67-89) не оказывал влияния на кератиноциты и только увеличивал [Ca (2+)] i в фибробластах. Дефицит витамина D у крыс увеличивал экспрессию мРНК ПТГрП в кератиноцитах и уменьшал ее в фибробластах и почках. Дефицит витамина D увеличивал экспрессию мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора в кератиноцитах и почках, но не в фибробластах. Хотя кератиноциты и фибробласты кожи являются клетками-мишенями для ПТГрП и экспрессируют ПТГ/ПТГрП-рецептор, два соседних типа клеток различаются в отношении их внутриклеточной передачи сигналов в ответ на ПТГрП-пептиды. Кроме того, витамин D регулирует ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептор специфично для разных клеток.
Blomme E.A. et al. (1999) исследовали влияние фактора роста кератиноцитов на секрецию и экспрессию ПТГрП нормальными кератиноцитами крайней плоти человека и эффекты ПТГрП на секрецию и экспрессию фактора роста кератиноцитов нормальными человеческими дермальными фибробластами in vitro. N-терминальный домен ПТГрП (1-36) увеличивал секрецию фактора роста кератиноцитов, экспрессию белка и экспрессию мРНК нормальными человеческими дермальными фибробластами дозозависимым образом, однако фактор роста кератиноцитов не влиял на экспрессию и секрецию ПТГрП кератиноцитами крайней плоти человека. По данным проточной цитометрии ПТГрП также увеличивал процент нормальных человеческих дермальных фибробластов, продуцирующих фактор роста кератиноцитов. Эти результаты показывают, что ПТГрП, продуцируемый кератиноцитами, является потенциальным паракринным регулятором экспрессии фактора роста кератиноцитов
дермальными фибробластами in vivo. Это паракринное регулирование может частично объяснять атрофию эпидермиса, наблюдаемую у мышей с делецией ПТГрП и гиперплазию эпидермиса у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих ПТГрП в их базальных кератиноцитах.
Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета1) вырабатывается многими клетками, включая кератиноциты, где он регулирует эпидермальный гомеостаз. Сообщалось, что TGF-бета1 косекретируется с ПТГрП в некоторых новообразованиях и стимулирует продукцию ПТГрП неопластическими кератиноцитами. Однако эффекты TGF-бета1 на продукцию ПТГрП нормальными кератиноцитами недостаточно изучены. Werkmeister J.R. et al. (1998) исследовали эффекты эндогенного и экзогенного TGF-бета1 на продукцию ПТГрП нормальными кератиноцитами крайней плоти человека. Секрецию ПТГрП, экспрессию мРНК и транскрипцию мРНК in vitro определяли с помощью N-концевого радиоиммунологического анализа, анализа защиты от рибонуклеазы и переходных трансфекций. Продукция ПТГрП и секреция скрытой активности TGF-бета1 были наибольшими в пролиферирующих кератиноцитах до и при слиянии монослойных культур. TGF-бета1 увеличивал экспрессию мРНК ПТГрП нормальными кератиноцитами дозозависимым образом с максимальной стимуляцией через 6–12 ч после воздействия. Кроме того, кератиноциты, обработанные моноклональным анти-TGF-бета-антителом, демонстрировали снижение уровня мРНК ПТГрП. Повышенные уровни мРНК ПТГрП после воздействия TGF-бета1, по крайней мере частично, были связаны с увеличением стабильности мРНК ПТГрП. TGF-бета1 не активировал транскрипцию репортерного гена люциферазы, приводимого промоторами ПТГрП человека или мыши. Авторы исследования заключили, что TGF-бета1 функционирует как паракринный или аутокринный регулятор продуцирования ПТГрП в нормальных кератиноцитах человека, и это может сыграть роль в регуляции их пролиферации или дифференцировки.
Sakai Y., Demay M.B. (2000) исходя из того, что ПТГрП экспрессируется в эпидермальных кератиноцитах и участвует в регуляции роста волос (Foley J. et al., 1998; Holick M.F. et al., 1994), а экспрессия ПТГрП в кератиноцитах человека подавляется 1,25 (OH) 2D3, выдвинули предположение о том, что сверхэкспрессия этого гормона кератиноцитами мышей с нокаутом рецептора витамина D может привести к облысению. Чтобы прояснить эту гипотезу, авторы исследовали экспрессию ПТГрП в культивируемых кератиноцитах, выделенных из мышей с нокаутом рецептора витамина D и однопометников дикого типа. ПТГрП экспрессировался на нормальных уровнях в клетках у мышей с нокаутом рецептора витамина D. Экспрессия ПТГрП в кератиноцитах контрольных мышей дикого типа была подавлена на 1,25 (OH) 2D3 при пролиферации и дифференцировании. Поэтому, несмотря на то, что репрессия мРНК ПТГрП на 1,25 (OH) 2D3 зависит от нокаута рецептора витамина D, базальная экспрессия этого протеина в кератиноцитах у этих нокаутных мышей не изменяется.
Kremer R. et al. (1991) изучили экспрессию и секрецию эндогенного ПТГрП в первичных культурах нормальных кератиноцитов человека. В ответ на факторы роста и эмбриональную бычью сыворотку, экспрессия мРНК ПТГрП и иммунореактивное высвобождение ПТГрП в кондиционированную среду быстро увеличивалось (в течение нескольких часов). Эти эффекты ингибировались 1,25-дигидроксивитамином D3 [1,25 (OH) 2D3]. На эти ранние ответы не влияло повышение концентрации кальция от 0,15 до 1,0 мМ. Напротив, увеличение средней концентрации кальция до 1,0 мМ, добавление 1,25 (OH) 2D3 или их комбинация привели к задержке увеличения (через несколько дней) продукции ПТГрП, что было связано с увеличением клеточной дифференцировки. Чтобы исследовать, действуют ли эти факторы на уровне транскрипции гена ПТГрП, серия векторов была получена путем слияния сегментов 5′-фланкирующей области гена ПТГрП крысы с репортерным геном гормона роста. Переходная трансфекция этих конструкций в культивируемые кератиноциты и измерение иммунореактивного гормона роста в среде показала, что область, стимулированная факторами роста, содержит цис-действующие элементы, которые положительно реагируют на сыворотку и отрицательно до 1,25 (OH) 2D3. Эти комбинированные исследования показали, что в нормальных кератиноцитах человека факторы роста могут резко стимулировать уровни мРНК ПТГрП и высвобождение ПТГрП, тогда как 1,25 (OH) 2D3 ингибирует эти ответы. По крайней мере, часть этих эффектов находится на уровне транскрипции гена. Кроме того, синтез и высвобождение ПТГрП усиливаются в условиях, в которых индуцируется дифференцировка кератиноцитов.
Секрецию ПТГрП нормальными и неопластическими кератиноцитами, сравнивали in vitro, чтобы определить, влияет ли злокачественный фенотип на регуляцию экспрессии и секреции этого белка (Rosol T.J. et al., 1994). Сравнивали три типа клеток: нормальные кератиноциты крайней плоти человека, клетки хорошо дифференцированной линии собачьей плоскоклеточной карциномы и клетки плохо дифференцированной линии карциномы человека. Клетки выращивали в монослоях и на субстратах (искусственная дерма или коллаген), чтобы индуцировать трехмерное расслоение клеток и обеспечить сбор среды из базальной и апикальной областей клеток. Секрецию ПТГрП измеряли с помощью N-концевого радиоиммуноанализа, а продуцирование мРНК измеряли с помощью анализа защиты РНКазы. Секреция мРНК ПТГрП клетками нормальных кератиноцитов крайней плоти человека и собачьей плоскоклеточной карциномы в монослойной культуре была максимальной при слиянии и затем уменьшалось. Напротив, клетки карциномы человека продолжали продуцировать ПТГрП после слияния в монослойных культурах. Секреция ПТГрП была наибольшей из базальных клеток по сравнению с апикальными клетками культур. Трансформирующий фактор роста-β1 увеличивал мРНК ПТГрП в нормальных кератиноцитах крайней плоти человека через 6 часов и в клетках собачьей плоскоклеточной карциномы через 1–24 часа. Эти данные показывают, что ПТГрП продуцируется преимущественно пролиферирующими кератиноцитами, а регуляция продукции ПТГрП отличается в обычных кератиноцитах по сравнению с клетками карциномы.
Существующие данные свидетельствуют о том, что продукция ПТГрП может быть связана с степенью дифференцировки кератиноцитов in vitro. Исследование секреции ПТГрП нормальными кератиноцитами крайней плоти человека во время как спонтанно возникающей, так и индуцированной дифференциации in vitro было выполнено (Werkmeister J.R., et al., 1993). Продукцию ПТГрП в кератиноците без кондиционированной среды определяли с использованием N-концевого радиоиммуноанализа для ПТГрП человека (1-36). Для изучения способности изменять продукцию ПТГрП использовали факторы, которые, как известно, стимулировали (кальций, 1,25-дигидроксивитамин D3) или ингибировали (трансформирующий фактор роста-β1) функционирование кератиноцитов. Измерения количества клеток и содержания инволюкрина в культурах были сделаны для подтверждения влияния этих агентов на рост и дифференциацию кератиноцитов. Производство ПТГрП в контрольных культурах (при низких концентрациях кальция) уменьшалось, а содержание инволюкрина увеличивалось после того, как клетки стали конфлюэнтными. Добавление 1 мМ кальция к кератиноцитарной среде увеличивало число клеток и содержание инволюкрина в культурах, но ингибировало продукцию ПТГрП. 1,25-дигидроксивитамин D3 не оказывал существенного влияния на количество клеток или продукцию ПТГрП, но увеличивал содержание инволюкрина. Трансформирующий фактор роста β1 уменьшал как количество клеток, так и содержание инволюкрина, но значительно стимулировал продукцию ПТГрП. Эти данные свидетельствуют о том, что продуцирование ПТГрП нормальными кератиноцитами крайней плоти человека ингибируется с началом как спонтанно возникающей, так и индуцированной кальцием дифференцировки in vitro, в то же время трансформируя дифференцировку и повышая ПТГрП продукцию в нормальных кератиноцитах человека под влиянием трансформирующего фактора роста β1.
В клеточной культуре кератиноциты продуцируют ряд биологически активных факторов подобных эпидермальному фактору роста (EGF) являющихся лигандами-рецептора эпидермального фактора роста ErbB1 (трансформирующий фактор роста-альфа, Гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста и амфирегулин). Передача сигналов через рецептор ErbB1 является основным активатором генной экспрессии ПТГрП в пролиферирующих кератиноцитах. Сообщалось, что EGF является мощным стимулятором экспрессии гена ПТГрП во многих типах клеток (Ferrariet S.L. et al., 1994; Heath J.K. et al., 1995; Cramer S.D. et al., 1996). Опираясь на эти факты Cho Y.M. et al. (2004) предположили, что присутствие EGF в качестве «ростового фактора» в культуральных средах кератиноцитов может активировать генную экспрессию ПТГрП. Чтобы проверить эту гипотезу, авторы измерили транскрипты мРНК ПТГрП в образцах, полученных из культур кератиноцитов с EGF и без него, и затем обработали ингибитором ErbB1 PD153035. Наличие или отсутствие EGF не влияло на уровни мРНК ПТГрП в кератиноцитах. Воздействие на кератиноциты специфического ингибитора erbB1 (PD153035) уменьшило уровень мРНК ПТГрП в быстрорастущих кератиноцитах. на 82–85 % по сравнению с необработанными образцами. Эти результаты свидетельствуют о том, что активность рецептора ErbB1 является основным стимулятором экспрессии гена ПТГрП в неконфлюентных культурах кератиноцитов в присутствии или отсутствии экзогенных добавок роста, включая EGF. Эндогенный амфирегулин стимулирует экспрессию гена ПТГрП. Внесение в культуральную среду антител к амфирегулину вызывало дозозависимое снижение уровня мРНК ПТГрП на 60 %. В культивируемых кератиноцитах ErbB1 может быть активирован посредством эндогенно продуцируемых EGF-подобных лигандов (Pittelkow M.R. et al., 1993, Piepkorn M. et al., 1998). Авторы работы полагают, что продуцирование EGF-лигандов, особенно амфирегулина, в культивированных кератиноцитах активирует erbB1, что приводит к относительно высоким уровням экспрессии гена ПТГрП. Существенное снижение уровней мРНК ПТГрП, достигаемое под воздействием PD153035, а также антител амфирегулина, свидетельствует о том, что продуцирование ПТГрП в культивируемых кератоцитах в значительной степени активировано посредством аутокринной стимуляции ErbB1 амфирегулином. Полученные результаты позволил предположить, что для активации erbB-активация экспрессии гена ПТГрП развивается после связывания EGF и ему подобных лигандов с рецептором пErbB1, что приводит к его гомодимеризации и последующей активации каскада ras-raf-MEK-ERK, запускающего белки Ets для трансактивации ПТГрП-P3 промотера.
В эпидермисе отсутствие ПТГрП, по-видимому, приводит к преждевременной дифференциации базальных клеток и последующему уменьшению базального слоя. И наоборот, появление избыточной продукции ПТГрП задерживает дифференциацию базальных клеток и увеличивает количество пролиферирующих клеток. Неясно, обусловлено ли увеличение пролиферация базального слоя часто наблюдаемое в эпидермисе трансгенных мышей K14-ПТГрП, прямыми эффектами избыточной секреции ПТГрП или является вторичным следствием задержки дифференциация, приводящей к увеличению клеточных делений внутри этого слоя эпидермиса. ПТГрП-индуцированная задержка клеточной дифференцировки соответствует наблюдавшемуся увеличению числа себоцитов в сальных железах трансгенных мышей K14-ПТГрП. ПТГрП играет важную роль в морфогенезе и размножении ряда систем и органов, однако ПТГрП не требуется для морфогенеза или созревания кожи и ее придатков. Таким образом, ПТГрП появляется, чтобы играть роль в регулировании скорости дифференцировки базальных кератиноцитов, развития сальных желез и структуры дермы в коже взрослой мыши. Однако это регулирование может иметь более важное значение для процесса старения, чем для развития эпидермиса и его придатков как такового.(Foley J. et al., 1998).
Было высказано предположение, что ПТГрП связывается с рецепторами в клетках дермального сосочка и модулирует внутриклеточные сигнальные системы в этих клетках. Thomson M., et al., (2003) протестировали эффекты ПТГрП на синтез белка, протеинкиназу A и активность протеинкиназы C, а также фосфорилирование тирозина в кожном сосочке крысы и капсулярных фибробластах. Клетки культивировали в присутствии или в отсутствие N-концевого пептида ПТГрП (1-34) в течение 48 ч и готовили экстракты. Экстракты клеток дермального сосочка и капсулярных фибробластов проявляли иммунореактивность к рецептору ПТГ/ПТГрП. Присутствие в культуральной среде ПТГрП уменьшило содержание белка в клетках дермального сосочка, но не в капсулярных фибробластах. В культуральной клеточной среде зафиксированы аналогичные изменения, что указывает на то, что белок ПТГрП был секретирован. Активность протеинкиназы A и активность протеинкиназы C клеток сосочков не изменились под воздействием ПТГрП. Однако активность протеинкиназы C была увеличена, а протеинкиназы A уменьшалась в капсулярных фибробластах после их культивации в присутствии пептида. Эти клеточные эффекты показали, что эндогенный ПТГрП может активировать различные внутриклеточные пути в мезенхимальных клетках кожи и вызывать изменения уровней локально секретируемых белков, которые специфически модулируют нормальную фолликулярную функцию.
В волосяном фолликуле рецепторы ПТГ/ПТГрП локализованы в дермальной оболочке и дермальном сосочке развивающихся волос. Активация ПТГ/ПТГрП-рецепторов в волосяном фолликуле регулирует в цикле волос переход от анагена к катагену (Sehgal V.N. et al., 2013; Wysolmerski J.J. et al., 1994). Наличие высоких концентраций ПТГрП в волосяных фолликулах обуславливает его роль в паракриной или аутокринной регуляции роста волос (Hayman, J.A. et al., 1989). ПТГрП участвует в регуляции цикла волосяного фолликула. Во время цикла в волосяных фолликулах модулируется высокий уровень транскриптов мРНК ПТГрП и мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора. Цикл волос координируется сложным взаимодействием пула регуляторных молекул развития между компонентами эпидермального волосяного фолликула и дермальным сосочком/дермальной оболочкой (Millar S.E., 2002). Экспрессия ПТГрП и его рецептора в волосяном фолликуле изменяется во время цикла волос, в зависимости от метаболического статуса. Уровень мРНК ПТГрП снижается в начале анагена, а затем возрастает во время позднего анагена, когда транскрипты ПТГрП обнаруживаются во внешней корневой оболочке непостоянной части волосяного фолликула (Cho Y.M. et al., 2003). Кроме того, анаген требует обширного ангиогенеза для удовлетворения метаболических потребностей быстро пролиферирующих клеток матрицы, которые продуцируют волосяной вал (Mecklenburg L. et al., 2000). В отличие от транскриптов ПТГрП экспрессия мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора очень низка у взрослых мышей, но увеличивается во время раннего анагена, поскольку транскрипты становятся обнаруживаемыми в оболочке соединительной ткани, которая окружает растущий волосяной фолликул (Cho Y.M. et al., 2003). Расположение мРНК ПТГрП и мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора предполагает, что пара лиганд-рецептор может участвовать в эпителиально-мезенхимальных взаимодействиях, которые контролируют рост волос.
Существуют доказательства роли взаимодействия ПТГрП с рецептором ПТГ/ПТГрП в регуляции роста волос. Антагонист ПТГ/ПТГрП-рецептора (ПТГ 7-34 амид), вводимый неонатальным и взрослым мышам, увеличивал продолжительность анагена (Holick M.F. et al., 1994; Schilli M.B. et al., 1997), тогда как применение in vivo агонистов (ПТГ 1-34 и ПТГрП 1-34) вызывало преждевременный катаген (Peters E.M. et al., 2001).
Эти результаты подтверждались наблюдением, что волосы на дорзальной поверхности у трансгенных мышей, гиперэкспрессирующих ПТГрП (мыши K14-ПТГрП) на 30–40 % короче, а волосяные фолликулы входят в катаген, примерно на 2 дня раньше (Cho Y.M. et al., 2003). Таким образом, N-концевой домен ПТГрП, по-видимому, модулирует цикл волос, но, как эта сигнализация влияет на поведение клеток в волосяном фолликуле, детально не выяснено. ПТГрП также продуцируется клетками внутренней корневой оболочки волосяного фолликула. Непостоянная часть волосяного фолликула претерпевает апоптоз во время катагена (Diamond A.G. et al., 2006). Экспрессия мРНК ПТГ/ПТГрП-рецептора, которая является самой высокой во время ангиогенеза, относительно мала в зрелом возрасте, только увеличиваясь во время раннего анагена в оболочке соединительной ткани, которая окружает растущий волосяной фолликул (Cho Y.M. et al., 2003). Сигнальный путь опосредованный ПТГ/ПТГрП-рецептором является частью комплексной эпителиально-мезенхимной перекрестной регуляции движения волос (Diamond A.G. et al., 2006).
У трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих ПТГрП (мыши K14-ПТГрП) с выявленным 10-кратным увеличением содержания ПТГрП в коже, выявили нарушения роста и функционирования волосяных фолликулов. У этих мышей выявлено фенотипическое несоответствие между дорзальной и вентральной кожей. Избыточная экспрессия ПТГрП приводила к умеренной задержке в начальном развитии волосяных фолликулов плода на спинной поверхности. Однако вентральная кожа была почти полностью лишена волосяных фолликулов, имела утолщенный гиперкератотический эпидермис и расширенный гиперклеточный дермальный слой. Сверхэкспрессия ПТГрП сопровождалась преждевременным прекращением фазы анагена и запуском фазы катагена в цикле развития волос (Wysolmerski J.J. et al., 1994). В физиологических условиях высокий уровень продукции ПТГрП выявлен в конце фазы анагена. У трансгенных мышей, с гиперэкспрессией этого белка в коже имело место развитие алопеции, а введение животным антагониста ПТГрП приводит к увеличению количества волосяных фолликулов в анагене и вызывает усиленный рост волос. У «спасенных» нокаутных мышей развивается чрезмерное ороговение кожи и образуется избыточный волосяной покров тела. Наоборот, алопеция приводит к тому, что ПТГрП сверхэкспрессируется в коже.
Представлены убедительные доказательства того, что ПТГрП является эндогенным антипролиферативным фактором, который участвует в регуляции клеток эпидермиса и функционирования волосяного фолликула. (Holick M.F. et al., 1994). Авторы работы полагают, что антипролиферативная активность ПТГрП (1-34) может быть ценным инструментом для клинического применения при гиперпролиферативных расстройствах кожи, таких как псориаз. Способность блокирования эндогенной антипролиферативной активности ПТГрП в коже его антагонистом ПТГрП (7-34) потенциально может быть использовано для повышения эпидермального роста в пожилой коже и во время заживления ран, а также для стимулирования роста волос.
Для выяснения точной роли ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептора в цикле волос Diamond G. et al., (2006) использовали линии мышей с целенаправленной делецией как ПТГрП, так и ПТГ/ПТГрП-рецептора вместе с серией исследований волосяных фолликулов на мышах K14-ПТГрП, иперэкспрессирующих ПТГрП, чтобы определить функцию этой сигнальной системы в коже. Результаты экспериментов показали, что избыточная экспрессия ПТГрП способствует сокращению цикла волос за счет снижения пролиферации в матрице во время позднего анагена. Высокий уровень экспрессии ПТГрП индуцировал у взрослых животных формирование более коротких волос. Морфометрический анализ показал, что снижение пролиферации в матрице предшествовало появлению более тонких волосяных фолликулов и валов во время позднего анагена. Окрашивание CD31 показало, что волосяные фолликулы мышей K14-ПТГрП в поздней стадии фазы анагена были окружены уменьшенным количеством капилляров меньшего диаметра по сравнению с контрольными животными. Мыши, которые сверхэкспрессировали ПТГрП, меньше индуцировали развитие сосудистой системы волосяного фолликула. Повышенная экспрессия ПТГрП коррелировала с уменьшенным сосудистым руслом кожи взрослых животных, а отсутствие ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецепторов ассоциировалось с повышенной сосудистой структурой в коже плода. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что влияние ПТГрП на цикл волос частично опосредуется его влиянием на ангиогенез. Авторы полагают, что ПТГрП-опосредованное ингибирование ангиогенеза во время цикла волос может объяснить некоторые эффекты пептида на рост волос. Таким образом, антагонисты и агонисты ПТГ/ПТГрП-рецепторов могут являться потенциальными средствами терапии расстройств цикла волос или других кожных заболеваний с компонентами, зависящими от ангиогенеза.
С этой точки зрения, антагонисты ПТГ являются возможной мишенью для создания актуальных лекарственных препаратов, способствующих росту волос in vivo (Safer J.D. et al., 2007).
Установленные эффекты сигналов опосредуемых ПТГ/ПТГрП-рецептором предполагают, что лиганды этого рецептора могут быть кандидатами на роль фармпрепаратов, которые могут стимулировать или ингибировать рост волос. Поскольку антагонисты ПТГ/ПТГрП-рецепторов оказывают стимулирующее действие на пролиферацию клеток волосяного фолликула, они являются интересной потенциальной мишенью для создания таких препаратов (Holick M.F. et al., 2003; Schilli M.B. et al., 1997; Holick M.F. et al., 1996).
В недавней работе Gensure R.C. (2014) проанализированы данные исследований, посвященных роли ПТГрП в регуляции функционирования волосяных фолликулов. Эффекты ПТГрП на цикл волосяного фолликула изучались почти 20 лет и большинство из этих исследований демонстрируют влияние ПТГрП на прекращение фазы анагена, давая неполную картину общего эффекта ПТГрП на цикл волос. В нескольких экспериментальных исследованиях было показано содействие ПТГрП переходу волосяных фолликулов от анагена к фазе катагена. Это само по себе предполагает, что блокада ПТГрП может продлить фазу анагена и способствовать росту волос. Однако клинические испытания с местно применяемыми антагонистами ПТГ/ПТГрП-рецепторов были разочаровывающими, что привело к пересмотру этой гипотезы. Дополнительные исследования, проведенные на мышиных моделях, где повреждаются волосяные фолликулы (алопеция, индуцированная химиотерапией алопеция), показывают, что ПТГрП также влияет на ранний цикл волос, вход в фазу анагена и инициирует цикл волос. Хотя механизм этого еще не выяснен, это может включать активацию пути Wnt. Таким образом, общий эффект ПТГрП заключается в стимулировании и ускорении цикла волос, а в клинически значимых моделях выпадения волос, когда волосяные фолликулы были повреждены или стали покоящимися, предполагается, что агонисты, а не антагонисты могут способствовать росту волос.
Gensure R.C. (2014) и сам исследовал в эксперименте эффекты агонистов и антагонистов ПТГ/ПТГрП-рецепторов на цикл волосяных фолликулов ожидая увидеть улучшение роста волос под влиянием антагонистов ПТГ/ПТГрП-рецепторов. Однако фактические результаты показали совершенно противоположный ффект. Гистологическое исследование показало, что у животных, под влиянием агониста ПТГ/ПТГрП-рецептора, увеличилось количество волосяных фоликулов в фазе анагена и имелись признаки нивелирования дистрофических изменений от воздействия химиотерапевтических средств, тогда как антагонист ПТГрП вызвал незначительные эффекты.
Автор работы предложил гипотезу объясняющую эффекты ПТГрП на цикл волос, которые очень похожи на те, которые наблюдаются с гормоном щитовидной железы. ПТГрП вызывает активацию фазы анагена, вероятно, путем регулирования бета-катенина и LEF-1. ПТГрП также ускоряет переход волосяного фолликула от анагена к фазе катагена, обеспечивая общий эффект ускорения цикла волос. В моделях, где нарушается переход анагена в катаген, агонисты ПТГрП уменьшают рост волос за счет восстановления нормального окончания цикла волос (Diamond G. et al., 2006). В моделях, где повреждены волосяные фолликулы, агонисты ПТГрП могут ускорять рост и восстанавливать поврежденные волосяные фолликулы, ускоряя цикл волос. Антагонисты ПТГрП могут индуцировать парадоксальное кратковременное увеличение роста волос, вызванное продлением фазы анагена существующих фолликулов, но их долгосрочный эффект заключается в подавлении цикла волос и уменьшении роста волос.
(Skrok A. et al., 2015) показали, что применение лигандов ПТГ/ПТГрП-рецепторов вызывало положительные изменения в росте волос, особенно при алопеции индуцированной химиотерапией. Стимулирующий волосы эффект антагониста рецептора ПТГ/ПТГр, примененный местно к коже, наблюдался у бесшерстных мышей, а также у мышей, получавших циклофосфамид. Эти данные указывают на то, что лиганды ПТГ/ПТГрП-рецепторов могут быть безопасными и потенциально эффективными актуальными лекарственными средствами при профилактике или лечении алопеции.
В рамках одной главы невозможно представить существующую информацию о многогранных эффектах ПТГрП в организме. Анализ данных литературы о влиянии этого протеина на отдельные системы и органы представлен в последующих главах монографии.
Утверждается, что ПТГрП является паракринным регулятором сердечно-сосудистой системы, но многое в роли этого белка в физиологии и патофизиологии сердца и сосудов в значительной степени остается неизвестным (Schĺüter K.D., 1999). (Данные о кардиоваскулярных эффектах подробно представлены в главе 4).
ПТГрП способен активировать базальную секрецию кортикостероидов. В надпочечниках обнаружены рецепторы как к ПТГ, так и к ПТГрП (Mazzocchi G. et al., 2001; Urena P. et al., 1993). ПТГрП и его рецепторы широко экспрессируются в центральной нервной системе, и, по всей видимости, влияют на выживание нейронов несколькими механизмами. (Литературные ланные об эффектах ПТГрП в ЦНС представлены в главе 6).
Все вышесказанное позволяет заключить, что ПТГрП оказывает выраженное воздействие на большое количество морфофункциональных, биохимических и патофизиологических процессов. Новые исследования этого мультипотентного биологически активного фактора наверняка выявят дополнительные эффекты в этой сложной системе.
Приведенные в данной главе сведения безусловно не охватывают всей существующей по рассматриваемой теме информации, но в значительной мере представляют наиболее важные факты и аргументированные суждения авторов публикаций, которые были проанализированы в рамках представленного вниманию читателей этого раздела монографии.