Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

5.4.2.2.1. Тканевая инженерия суставного хряща с использованием аутологичных хондроцитов

Стратегии на основе клеток, направленные на восстановление суставного хряща, преимущественно фокусируются на использовании двух типов клеток, либо зрелых хондроцитов или мезенхимальных стромальных клеток, оба из которых имеют свои ограничения. Будучи клеточной единицей суставного хряща, хондроциты являются логичным выбором для использования в репаративных подходах на основе клеток, но все же есть ряд недостатков в их успешном использовании: во-первых, относительно ограниченная доступность донорских сайтов с относительно низким выходом клеток, выделенных из аутологического устройства (1–5 % от общего объема ткани); во-вторых, отсутствие подходящих протоколов расширения культуры in vitro, которые снижают риск дедифференцировки хондроцитов, в результате чего появляется фенотип фибробластоподобных клеток (Benya P.D., Shaffer J.D., 1982). Во время монослойного расширения синтез коллагена II типа и аггрекана, обычно продуцируемого в гиалинном хряще, снижается, в то время как производство коллагена I типа увеличивается (Darling E.M., Athanasiou K.A., 2005). Дедифференцированные хондроциты в основном становятся волокнистым, а не гиалиновым хрящем (Tew S.R., Clegg P.D., 2011) с более низкими биомеханическими свойствами (Peterson L., et al., 2000; Roberts S., et al., 2003), что ограничивает применение суставных хондроцитов при восстановлении хряща.

Суставные хондроциты являются самыми ранними используемыми источниками клеток для трансплантация аутологичных хондроцитов. Пионерами в этом направлении считаются Brittberg M., et al. (1994), опубликовавшие первые результаты лечения хрящевых дефектов в коленном суставе. Трансплантация аутологичных хондроцитов имеет то преимущество, что не нарушается зона костно-хрящевого соединения и используются клетки на заключительных стадиях дифференцировки, то есть с более детерминированной направленностью своего развития. Среди различных типов клеточных культур, представляющих интерес для трансплантации аутологичных хондроцитов, рассматриваются монослойные, трехмерные культуральные системы и модели культуральных систем, предназначенные для тканевой инженерии. В настоящее время монослойная культура остается основным способом получения хондроцитов в виде суспензии для трансплантации аутологичных хондроцитов. Главным недостатком монослойной культуры признается утрата фенотипа хондроцитами во время пассажей. Гистологическое строение таких клеток начинает напоминать фибробласты, они теряют способность секретировать протеогликаны. Трансплантация хондроцитов считается золотым стандартом в восстановлении суставного хряща для пациентов с большими размерами пораженной суставной поверхности а долгосрочные последствия продемонстрировали улучшение клинических симптомов (Peterson L., et al., 2000; Peterson L., et al., 2003). Однако, несмотря на эти положительные результаты, по-прежнему существуют недостатки, в том числе инвазивность хирургии и потенциал для дедифференцировки хондроцитов in vitro с последующей сниженной способностью формировать внеклеточный матрикс при трансплантации хондроцитов (Pelttari K., et al., 2008). Реализации технологии в настоящее время включают второе и третье поколение ACI (Marlovits S., et al., 2006). Во втором поколении трансплантации аутологичных хондроцитов биоабсорбируемый 3D-слой используется в качестве носителя клеток для имплантации в место дефекта (Behrens P., et al., 2006).

Современное понимание возможностей трансплантации аутологичных хондроцитов и полученные данные позволяют отнести этот метод к весьма перспективным. Результаты трансплантации аутологичных хондроцитов, в целом, свидетельствуют о том, что более чем у 80 % пациентов было получено улучшение при относительно небольшом количестве осложнений. (Knutsen L. et al., 2007; Wasiak J., Villanueva E., 2006; Gracitelli G.C., et al., 2016). Трансплантация аутологичных хондроцитов используется в клинике более двух десятилетий, является нынешним «золотым стандартом» и рассматривается как метод выбора для биологического восстановления дефектов хрящевой ткани (Harris J.D., et al., 2010), хотя он показал неоднозначные результаты в ряде клинических и экспериментальных исследований (Macmull S., et al., 2011; Tins B.J., et al., 2005). Существуют дискуссионные вопросы о сохранении достигнутого уровня результатов в отдаленные сроки и преимуществах трансплантации аутологичных хондроцитов перед иными способами хондропластики. В целом констатируется, что культивированные аутологичные хондроциты могут быть использованы для восстановления дефектов хряща.

В последнее время расширяется применение технологии имплантации аутологичных хондроцитов основанной на использовании матрицы. В отличие от обычной трансплантации аутологичных хондроцитов, эта технология требует инкубации расширенных аутологичных хондроцитов на смешанной коллагеновой мембране до имплантации (Nixon A.J., et al., 2015; Basad E., et al., 2015). Последнее утверждение Управления по контролю за продуктами и лекарствами США о клиническом использовании аутологичных культивируемых хондроцитов на мембране из свиного коллагена для восстановления симптоматических дефектов коленного сустава является позитивным моментом в ракурсе дальнейшего расширения использования потенциала клеточной терапии различных патологических изменений хряща (Lee W.Y.-W., Wang B., 2017). В 2017 году были сообщены результаты первого этапа первого клинического испытания с использованием аллогенных МСК у пациентов с фокальным дефектом хряща (de Windt T.S., et al., 2017). В исследовании, анализировали результаты аутологичной трансплантации хондронов, содержащих хрящевые клетки единого происхождения в комплексе с прилежащим к ним межклеточным веществом и аллогенными МСК. Полное заполнение дефекта и интеграция с окружающими тканями наблюдались по данным магниторезонансной томографии через 12 месяцев после операции. Кроме того, магниторезонансная томография, повторная артроскопия и гистологическая оценка показали образование гиалиновой ткани в месте дефекта.

Независимо от методологии регенерации хрящевой ткани, хондроциты вновь регенерированного хряща остаются восприимчивыми к воздействию воспалительных и механических факторов, которые, как известно, лежат в основе остеоартрических заболеваний. Поэтому меры хондрозащиты должны быть разработаны для хондроцитов регенерированного хряща, которые находятся в непосредственной близости к биоактивным факторам внеклеточных матриц и воспалительным агентам, ответственным за дегенеративный остеоартрит. Последующие изменения, связанные с артритом, и аберрантное функционирование этих хондроцитов, вероятно, вступают в компромисс с интеграцией, функцией и долговечностью регенерированного хряща (Djouad F., et al., 2009). Таким образом, хондрозащита регенерированного хряща от основного заболевания может обеспечить более долговременный терапевтический эффект.

Предыдущие сообщения указывают на то, что многие из биологических изменений суставных хондроцитов во время прогрессирования остеоартрита аналогичны тем, что имеют место в пластине роста хряща во время эндохондральной оссификации. В частности, суставные хондроциты вновь вводят последовательность фенотипических изменений, которые начинаются с гипертрофии клеток и продолжаются их минерализацией и апоптозом Kirsch T., et al., 2000; Tchetina E.V., et al., 2005; Pfander D., et al., 2001; Aigner T., et al., 2004). В остеоартритном хряще обнаружена повышенная экспрессия гипертрофических маркеров, включая коллаген X типа, Ihh, MMP-13 и щелочная фосфатаза (Aigner T., et al., 2006; Wang X., et al., 2004). Поскольку считается, что прогрессирование дегенеративного каскада при остеоартрите связано с потерей ингибирующего контроля над генами дифференцировки, предположили, что антигипертрофическая терапия может защищать здоровые хондроциты от артритоподобных изменений. ПТГрП является важным фактором передачи сигналов в регуляции эндохондральной оссификации в эпифизарно-ростовой пластине длинных костей, участвуя в регуляциии хондрогенеза пролиферирующих хондроцитов и подавлении их терминальной дифференцировки. ПТГрП сохраняет функцию пролиферирующих хондроцитов и ингибирует дифференцировку хондроцитов в сторону гипертрофии в пластине роста (Vortkamp A. et al., 1996). Показано, что антигипертрофическая активность обусловлена связыванием N-терминального домена ПТГрП с его рецептором клеточной поверхности, активирующим Sox9 (Bastepe M., et al., 2004; Huang W., et al., 2001). Внутри клеток из молекулы ПТГрП под воздействием конвертаз образуется ряд пептидных фрагментов. Несколько прямых эффектов этих фрагментов делают ПТГрП привлекательным инструментом для целей хондрозащиты. Поэтому биологические эффекты ПТГрП могут быть использованы для суставной хондропротекции.

Wang D., et al. (2011) исследовали использование избыточной экспрессии ПТГрП суставными хондроцитами для подавления артритоподобных изменений, вызванных механической травмой. Были испытаны две изоформы: ПТГрП (1-141) и ПТГрП (1-173). Бычьи хондроциты были трансфицированы конструкциями человеческого ПТГрП. Для стимулирования артритных изменений бычьих суставных хондроцитов in vitro использовалась модель циклического растягивающего воздействия, которая индуцировала фенотип изменений хондроцитов, включая повышенную экспрессию генов коллагеназ и аггреканаз, а также увеличение экспрессии гена, маркера гипертрофии хондроцитов коллагена X типа. Под воздействием циклического растягивающего воздействия возрастала эндогенная экспрессия гена бычьего ПТГрП, что соответствовало увеличению секреции ПТГрП, наблюдаемой в человеческом остеоартритном хряще (Terkeltaub R., et al., 1998; Okano K., et al., 1997) и свидетельствующей о самовосстановлении поврежденного хряща (Gomez-Barrena E., et al., 2004).

Поскольку период полураспада N-концевого фрагмента составляет обычно от 6 до 8 мин (Henry J.G., et al., 1997) в конечном итоге требуется постоянная доставка ПТГрП, чтобы ингибировать проявления артритоподобных изменений для достижения оптимальных терапевтических результатов. Такой механизм устойчивой доставки ПТГрП авторы обеспечили путем невирусного переноса гена человеческого ПТГрП c ДНК в сами суставные хондроциты. Как и ожидалось, хондроциты, экспрессирующие экзогенный человеческий ПТГрП, показали более высокие уровни секреции общего ПТГрП (бычьего и человеческого), чем контрольные. Сверхэкспрессия изоформ человеческого ПТГрП ингибирует индуцированную механической деформацией и базальную экспрессию гена коллагена X типа в суставных хондроцитах. Циклическое растягивающее воздействие увеличило производство NO и простагландина-E2, которые оба действуют как сильные катаболические сигналы в хряще, изменяя функцию хондроцитов и улучшая их апоптотический потенциал (Goldring M.B., Berenbaum F., 2004). Хотя известно, что ПТГрП стимулирует высвобождение NO из эндотелиальных клеток для локальной регуляции сосудистого тонуса (Kalinowski L., et al., 2001), не выяснен возможный механизм опосредованного ПТГрП высвобождения NO в хондроцитах. Кроме того исследования показали, что простагландин-E2 увеличивает продукцию ПТГрП в хондроцитах (Yoshida T., et al., 1998; Yoshida T., et al., 2001). Это исследование демонстрирует, что избыточная экспрессия ПТГрП ингибирует гипертрофические синдромы суставных хондроцитов, индуцированные механическим воздействием. Установлено, что хондроциты, сверхэкспрессирующие ПТГрП, резистентны к гипертрофическим изменениям, вызванным механическими деформациями. Терапевтический перенос гена ПТГрП можно рассматривать для применения хондрозащиты в недавно регенерированном хряще.

Как известно, регенерация хрящевой ткани является многоступенчатым динамическим процессом, и различные конкретные факторы могут определять эффективность процесса на определенном этапе. Процесс восстановления суставного хряща часто сопровождается гипертрофией хондроцитов и непреднамеренной эндохондральной оссификацией. ПТГрП продуцируется в суставных хондроцитах и регулирует скорость их дифференцировки. ПТГрП ингибирует терминальную дифференцировку суставных хондроцитов и МСК и участвует в защите суставного хряща (Macica C., et al., 2011). Это исследование подтвердило гипотезу о том, что ПТГрП может иметь регулирующую роль в поддержании суставных хондроцитов. Кроме того, экспрессия ПТГрП снижена в пораженной ткани хряща (Gelse, K., et al., 2012). Таким образом, экзогенный ПТГрП может дополнять потенциал торможения терминальной дифференцировки, тем самым улучшая восстановление хряща. В экспериментах на кроликах с моделированием глубоких дефектов хряща коленного сустава Kudo S., et al. (2011) активировали ПТГ/ПТГрП-рецепторы путем введения в суставную полость непрерывно либо прерывисто рекомбинантного человеческого ПТГ. Установлено, что непрерывное или прерывистое введениение ПТГ на ранней стадии восстановления успешно индуцировало хондрогенез в репаративной ткани дефектов хряща. Констатировано, что введение ПТГ в течение первых 2 недель индуцирует появление пролиферирующих хондропрогениторных клеток на участке восстановления. Образование хряща происходило через 4 недели как при непрерывном, так и при прерывистом введении ПТГ. Через 8 недель прерывистого введения ПТГ после моделирования травмы, регенерирующий хрящ заполнил дефекты и успешно восстановил исходное состояние сустава. Таким образом, прерывистая активация ПТГ/ПТГрП сигнализации на ранних стадиях процесса восстановления хряща облегчают индукцию регенеративного хондрогенеза при дефектах суставного хряща.

Zhang W., et al., (2013) исследовали эффективность стратегии тканевой инженерии путем комбинирования ПТГрП и коллагено-шелковых каркасов для восстановления остеохондрального дефекта. Анализ механизмов синергетического эффекта объединения введения ПТГрП с имплантацией коллагено-шелковых каркасов при восстановлении остеохондрального дефекта коленного сустава показал, что введениеПТГрП значительно уменьшало экспрессию маркеров, связанных с терминальной дифференцировкой, которое достигается частично за счет блокировки активации канонического Wnt/β-catenin сигнального пути. В исследовании восстановления хряща in vivo внутрисуставная инъекция ПТГрП кроликам проводилась в трех разных временных окнах (4–6, 7–9 и 10–12 недель) вместе с имплантацией двухслойного коллагено-шелкового каркаса. Дефекты, обработанные ПТГрП в окне времени 4–6 недель, показали лучшую регенерацию (восстановление хряща и субхондральной кости) с минимальной терминальной дифференцировкой (гипертрофия, оссификация и деградация матрицы), а также усиленный хондрогенез (клеточная форма, накопление коллагена II типа и гликозоаминогликана) по сравнению с эффектами в других временных окнах. Полученные результаты показали, что внутрисуставная инъекция ПТГрП через 4–6 недель после травмы вместе с имплантацией коллагено-шелковых каркасов является эффективной стратегией для ингибирования терминальной дифференцировки и усиления хондрогенеза, что улучшает восстановление и регенерацию хряща в модели остеохондрального дефекта (Zhang W., et al., 2016). Поэтому использование ПРТГрП в надлежащее время является критически значимым для получения эффективного результата восстановления хряща Полученные данные дают представление о понимании задействованных механизмов и прокладывают путь для клинического применения ПТГрП для восстановления остеохондральных дефектов (Zhang W., et al., 2014).

Вполне очевидно, что ПТГрП может использоваться для ограничения аномальной гипертрофии в процессе восстановления хряща. Декларируются две различные стратегии восстановления суставного хряща с использованием ПТГрП. В первом варианте рекомбинантный ПТГрП вводится в сустав непосредственно или с помощью биосовместимых инъекционных каркасов. Второй подход предусматривает использование генетических манипуляций включая доставку гена ПТГрП путем внутрисуставной инъекции генных конструкций или ПТГрП-трансфицированных клеток отдельно или в сочетании с инъекционными каркасами (Zhang W., et al., 2012). Генная терапия представляет собой новый подход, обеспечивающий постоянный синтез необходимых белков в целевых сайтах in vivo. Было проведено несколько исследований, посвященных регенерации хряща с использованием гена ПТГрП. Генная терапия с использованием ПТГрП может быть проведена двумя способами. Ген ПТГрП, доставленный аденовирусом, лентавирусом или другими векторами, может быть непосредственно введен в совместное пространство синовиальных клеток, суставных хондроцитов и МСК, так что они будут секретировать ПТГрП. Альтернативно ген ПТГрП можно трансфицировать в культивируемые клетки, такие как хондроциты, МСК и другие клетки, с последующей трансплантацией этих клеток в целевые локусы для устойчивого производства ПТГрП (Xian C.J., Foster B.K., 2006). Несколько подходов к генной терапии в настоящее время исследуются для устранения дефектов хряща и ингибирования прогрессирования остеоартрита. Однако имеется проблема безудержного производства ПТГрП при генной терапии, аналогичная чрезмерному введению рекомбинантного ПТГрП, поэтому уровень ПТГрП должен быть точно контролироваться и целесообразно управлять геном ПТГрП в течение этого периода. Разработаны различные стратегии регулирования, направленные на управление трансгенной экспрессией (Yazawa M., et al., 2009; Hundt W., et al., 2009), которые могут применяться для контроля экспрессии ПТГрП.

Активное изучение роли ПТГрП в хондрогенезе в физиологических условиях и при ряде патологических состояний и полученные в этих исследованиях результаты обусловили появление нескольких патентов, в которых обсуждались и предлагались новые подходы к использованию ПТГрП-индуцированных эффектов в решении проблем профилактики или лечения заболеваний, которые связаны с разрушением и дегенерацией хрящевой ткани. В 1997 году был зарегистрирован патент WO1997035607A1 «Методы индукции ткани с использованием комбинации костного морфогенетического белка и паратиреоидного гормона родственного пептида» (Methods of tissue induction using a combination of bone morphogenetic protein and parathyroid hormone-related peptide), авторами которого были Hattersley G. и Rosen V.A. Основные положения этого патента фиксируют, что изобретение относится к новым способам и композициям для восстановления, уменьшения или предотвращения повреждения хрящей и хрящевой ткани. Заявленные способы и композиции могут быть также полезны для индукции и поддержания образования хрящевой ткани, заживления ран хряща и других тканей. Запатентованные композиции содержат остеогенный или хрящеобразующий элемент надсемейства трансформирующего фактора бета [TGF-3], костный морфогенетический белок [BMP] в сочетании с ПТГрП. Композиции пригодны для индукции и поддержания суставного хряща. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения используется пептид, содержащий первые 34 аминокислоты N-концевой части молекулы ПТГрП (1-34). В конкретном варианте запатентованный способ лечения дефектов суставного хряща или повреждения включает введение пациенту эффективного количества вышеуказанных композиций. Способы и композиции могут быть также использованы для индукции и поддержания образования хрящевой ткани, заживления ран хряща и других тканей, таких как суставной хрящ, мениск и суставные поверхности развивающейся кости, или для лечения заболеваний, таких как артрит и особенно остеоартрит а также могут быть использованы в других показаниях для лечения или регенерации хрящевой ткани. Способы и композиции заявленные в этом патенте могут обеспечить среду для привлечения хрящеобразующих клеток, стимулировать их рост или индуцировать дифференциацию предшественников хрящеобразующих клеток и хондроцитов.

В патенте США № US 8,513,193 B2 (45) от 20.08.2013 представлены композиции и способы, связанные с защитой или восстановлением суставного хряща и/или скелетно-мышечной мягкой ткани, путем контактирования хряща, тканей или их клеточных компонентов с агонистом рецептора ПТГ/ПТГрП (PTH/PTHrP). Способ содействия защите или восстановлению хряща включает прерывистое введение агонистов рецептора ПТГ/ПТГрП или высвобождающего их агента для приготовления лекарственного средства. Указанные в патенте композиции и способы предназначены для защиты или ремонта суставного хряща и скелетно-мышечных мягких тканей, таких как неартикулярный хрящ, сухожилие, межпозвоночные диски, связка, мениск, и скелетные мышцы. Соединения могут вводиться в форме фармацевтической композиции в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Kato Y. et al. (2009) запатентовали препараты для профилактики или лечения заболеваний, которые связаны с разрушением и дегенерацией суставной хрящевой ткани, которые содержат ПТГрП или вещество, получаемое ПТГрП, содержащее в качестве эффективного ингредиента, аминокислоты 1-34 ПТГрП и фармацевтически приемлемый носитель (Patent CA2213261C). Пептид, который должен использоваться в изобретении, охватывает природный ПТГрП, ПТГрП созданный методами генной инженерии и химически синтезированный ПТГрП, и может быть человеческим, бычьим или свиным ПТГрП, состоящим из 141 аминокислоты, причем ПТГрП человека является предпочтительным. Термин «вещество, получаемое ПТГрП» означает пептидные фрагменты вышеуказанных вариантов ПТГрП, а также пептиды, которые получают путем частичной модификации аминокислот составляющих ПТГрП или их фрагментов посредством замещения, делеции или добавления и которые имеют одинаковую активность, причем человеческий ПТГрП (1-34) и человеческий ПТГрП (1-84) являются предпочтительными. Помимо инъекций, приготовленных обычными фармацевтическими рецептурами для пептидов, лекарственное средство по изобретению может использоваться в составе лекарственных форм, которые предназначены для достижения локализации и длительного действия, например, путем микрокапсул. Препарат может вводиться различными путями, такими как подкожный, пероральный, чрескожный, интраректальный и местный, причем местное введение является предпочтительным. Особенно предпочтительным является местное внесение в полость сустава или на пораженный участок путем инъекции. Доза ПТГрП в соответствии с изобретением варьирует в зависимости от заболевания, для которого оно указано, его симптомов и тому подобное.