Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН
Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,
5.4.2.3.1. Хондрогенная дифференциация мезенхимальных стволовых клеток. Эффекты факторов роста и сигнальной трансдукции
Мезенхимальные стволовые клетки становятся многообещающим источником клеток для регенерации хряща из-за способности к росту in vitro, без потери своего фенотипа. Значительное внимание уделяется повышению способности хондрогенной дифференциации. Несмотря на то, что МСК продемонстрировали большие перспективы в регенерации хряща, необходимо выполнение ряда условий, чтобы они могли эффективно дифференцироваться в хондроциты и поддерживать этот дифференцированный фенотип перед имплантацией. Эти условия включают методы и материалы для культивирования МСК, которые обеспечивают микроэкологический контроль их хондрогенеза. При оптимальных условиях культивирования, содержащих определенные экзогенные факторы, MSC могут быть направлены на хондрогенную дифференциацию. Фаза дифференцировки стволовых клеток в направлении хондрогенеза может быть разделена на различные стадии, включая прикрепление клеток, пролиферацию/дифференцировку и дифференцировку/гипертрофию (Mrugala D. et al., 2009).
Обычная система хондрогенеза стволовых клеток in vitro использует культуру гранул, где гранулы, содержащие от 200 000 до 500 000 клеток, подвергают хондрогенной индукции с базальной средой, содержащей коктейль дексаметазона, аскорбиновой кислоты, инсулина, трансферрина и селеновой кислоты. Трансформирующий фактор роста (TGF)-β (TGF-β1, 2 и 3) является наилучшим индуктором хондрогенеза, который приводит к образованию хряща с осаждением сульфатированных гликозаминогликанов (s-GAG) и коллагена II типа. Система культивирования гранул рекапилизует мезенхимальную конденсацию с взаимодействием клеток, необходимых для хондрогенеза (Toh W.S. et al., 2013). Однако эта обычная система культивирования с трансформирующим фактором роста-β может быть недостаточной для поддержания фенотипической стабильности образования хряща, и для индукции хондрогенеза в направлении стабильного образования хряща требуется более сложные сигналы (Toh W.S. et al., 2011b).
Хондрогенная дифференциация МСК также зависит от конкретных факторов роста и сигнальной трансдукции. Несмотря на то, что тканеинженерные конструкции хорошо разработаны для 3D-культуры, поддержание хондрогенного фенотипа проблематично при культивировании МСК только на каркасах, то есть без других локальных факторов in vivo. Чтобы преодолеть эти проблемы, используют ряд новых биоматериалов, инновационных технологий культивирования клеток и недавно обнаруженных факторов роста в соответствии с направлениями применения клеточных средств для тканевой инженерии. Факторы роста являются ключевыми регуляторами правильной дифференциации МСК (Hwang N.S., et al., 2006; Park S., et al., 2007). Факторы роста, которые способствуют хондрогенезу или демонстрируют хондрогенный эффект как in vivo, так и in vitro, включают морфогенетические белки (BMP), трансформирующие факторы роста-β (TGF-β1, TGF-β3), инсулин-подобные факторы роста (Linkhart T.A., et al., 1996; O′Driscoll S.W., 1999; Kil S.J. Carlin C., 2000). Продемонстрированы различия в требованиях к факторам роста для хондрогенной индукции стволовых клеток из разных источников, которые могут определяться особенностями пула рецепторов фактора роста, экспрессируемых клетками (Handorf A.M., Li W.-J, 2014). Своевременное применение факторов роста при оптимальной концентрации, комбинации и воздействии в зависимости от экспрессии соответствующих рецепторов фактора роста необходимо для улучшения хондрогенеза стволовых клеток в направлении стабильного образования хряща
Гипоксическая среда являются биоактивным агентом для индуцирования оптимального хондрогенеза МСК. Применение гипоксии во время хондрогенеза, дает последовательные результаты расширенной экспрессии хондрогенных генов и осаждения матриц в различных источниках МСК. Это подчеркивает роль гипоксии во время хондрогенеза, влияние которой опосредованного преимущественно гипоксически-индуцируемыми транскрипционнами факторами, (HIF-1α и HIF2α). Было показано, что HIF-1α улучшает хондрогенез МСК путем индуцирования экспрессии коллагена II типа во взаимодействии с промотором Sox9 (Robins J.C.et al., 2005). Гипоксия усиливает хондрогенную дифференцировку MSC с повышением активности коллагена II типа и аггрекана посредством активации пути АКТ и p38 MAPK (митоген-активированные протеинкиназы) (Kanichai M. et al., 2008; Hirao M. et al., 2006). В дополнение к хондрогенным эффектам гипоксия также оказывает антигипертрофическое и антикатаболическое действие на МСК и хондроциты с понижающей регуляцией экспрессии коллагена X типа, щелочной фосфатазы и матричной металлопротеиназы-13 (Sheehy et al., 2012; Strobel et al., 2010). Гипоксическая репрессия гипертрофии представляет собой комбинированный эффект регуляции посредством активации HDAC4 и Nkx3.2, а также ингибирование Smad6, что приводит к подавлению Runx2 и, следовательно, коллагена X типа (Kawato Y. et al., 2011). Однако в настоящее время взаимосвязь и основные механизмы HIF-1α и HIF-2α в катаболической регуляции хондрогенеза, приводящие к гипертрофии, до сих пор неясны.
Кроме вышеуказанных факторов индуцировать хондрогенез могут механические воздействия на хондроциты. Электромагнитное поле и комбинация усилий сдвига/динамического сжатия являются лучшими физическими стимуляторами соревания хондроцитов. (Ahmed T.A., Hincke M.T., 2014). Механическая стимуляция с использованием гидростатических нагрузок и растяжения клеток, среди других сил, была применена для активации путей механотрансдукции и содействия хондрогенезу в клетках. (Ogawa H., et al., 2014). Показано, что динамическая стимуляция (например, циклический сдвиг или динамическое сжатие) клеток приводит к образованию более прочного хряща по сравнению с стимуляцией клеток статическими силами. (Grodzinsky A.J., et al., 2000). При развитии хряща механические факторы играют важную роль взаимодействуя с сигнальным контуром Ihh-ПТГрП, регулирующим поддержание и дифференциацию суставных хондроцитов (Chen X., et al., 2008; Vortkamp A., et al., 1996).
Экспрессия мРНК ПТГрП возрастает с увеличением амплитуды циклического механического растяжения в культивируемых пластинчатых хондроцитах (Tanaka N. et al., 2005). Механическая стимуляция хондроцитов приводит к секреции ПТГрП, что существеннейшим образом влияет на хондрогенез (Xu T., et al., 2013). Таким образом, есть очевидные доказательства того, что биомеханическая стимуляция хондроцитов является значимым фактором способствующим хондрогенезу. Эти факты стали предпосылками для использования физиологической динамической деформационной нагрузки или скользящей контактной нагрузки при формировании тканеинженерного хряща на основе хондроцитов, что привело к улучшению его механических свойств и биохимических показателей (Lima E.G., et al., 2007; Mauck R.L. et al., 2000, 2002; Bian L., et al., 2010). Такие нагрузочные схемы имитируют циклические воздействия на хрящ in vivo в физиологических условиях, которые, необходимы для поддержания структуры и функции хондроцитов (Buckwalter J.A., Mankin H.J., 1998), а также для усиления конвекции питательных веществ через ткань (Mauck R.L., et al., 2003; Albro M.B., et al., 2008) Кроме того, сложное взаимодействие содержания коллагена и протеогликана обуславливаетк уникальные структурно-функциональные характеристики суставного хряща. Таким образом, применение физико-химических стимулов может модулировать структурную организацию (Kelly T.N., et al., 2006), количество и тип внеклеточного матрикса, что приводит к должным механическим свойствам сконструированной хрящевой ткани.
В последние годы реакции хондроцитарной клеточной среды и фенотипические изменения были исследованы в области биоакустофлюидики с использованием ультразвукового поля стоячей волны. В недавнем исследовании была разработана и охарактеризована новая акустофлуидная биореакторная система культивирования агрегатов человеческих суставных хондроцитов, которая применяет акустические силы для механического стимулирования клеток в долгосрочной культуре для создания 3D-гиалиноподобного хряща. Применяя ее исследовали и количественно определяли, как текучие сдвиговые напряжения, создаваемые биореактором, могут быть модулированы в электронном виде и оцениваются в результате различий в качестве образования хряща. Изменяя акустические параметры (амплитуда, частотная развертка и частота повторения развертки), клетки стимулировались колебательными напряжениями сдвига жидкости, которые динамически модулировались с разной частотой повторения развертки.
Механизм механической стимуляции, который способствовал образованию хряща, затем дополнялся фактором роста ПТГрП для улучшения образования гиалиноподобного хряща со структурными и механическими свойствами, сопоставимыми со свойствами человеческого хряща, что оценивалось иммуногистологией и наноиндексацией, соответственно. Поскольку создаваемая ткань представляет собой гиалиноподобный хрящ, его качество оценивали по матричной композиции протеогликанов и коллагена II типа. Затем фракции для этих маркеров сравнивали с коллагеном I типа (маркер для фиброартиляжа) и коллагена X типа (маркер для гипертрофического хряща).
Результаты исследования показали, что 21-дневные конструкции, сгенерированные в биореакторе в хондрогенных средах, дополненных ПТГрП, были большими по размеру, проявляли гиалиноподобную структуру хряща, демонстрировали устойчивую экспрессию SOX-9 и коллагена II типа, и, что важно, проявляли незначительную экспрессию коллагенов I типа и X типа. Кроме того, механический анализ ткани хряща с использованием наноиндексации показал, что сконструированные человеческие хрящевые конструкции имеют жесткость, аналогичную жесткости нативной человеческой хрящевой ткани. Результаты этого исследования демонстрируют способность акустофлюидиков обеспечивать настраиваемую биомеханическую силу для культуры и развития гиалиноподобных человеческих хрящевых конструкций in vitro и обеспечивают новую платформу для создания безкаркасных инженерных систем хрящевой ткани. (Jonnalagadda U.S., et al., 2018).