Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

Глава 6. ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН И ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА (Ледванов М.Ю., Курзанов А.Н., Заболотских Н.В.)

Центральная нервная система была одним из первых объектов подробного изучения локализации ПТГ/ПТГрП-рецептора, а также экспрессии гена ПТГрП в мозге крысы (Weaver D.R. etal., 1995). Обнаружено что, ПТГрП и его рецептор широко экспрессируются в центральной нервной системе (Weir E.C. et al., 1990) и особенно в коре головного мозга, гиппокампе и мозжечке [Fukayama S., et al., 1995; Macica C.M., et al., 2006; Urena P., et al., 1993]. ПТГрП экспрессируется конститутивно в головном мозге, главным образом нейронами, в том числе в теменной коре и полосатом теле (Weaver D.R., et al., 1995; Weir E.C. et al., 1990). В ЦНС крысы экспрессия гена ПТГрП была наивысшей в супрамамиллярном ядре гипоталамуса и в субпопуляциях клеток неостриатума, гиппокампа и коры головного мозга. Другие основные сайты экспрессии гена ПТГрП включали миндалину, центральные таламические ядра, ядра Варолиевого моста, сосудистое сплетение и переднюю долю гипофиза. Наивысшие уровни мРНК рецептора ПТГ/ПТГрП были в мезенцефалической части ядра тройничного нерва и тройничного ганглия, боковых ядрах ретикулярной системы и моста головного мозга, в ретикулотегментальных ядрах и гипоглоссальном ядре. Другие основные сайты экспрессии рецептора ПТГ/ПТГрП включали ядра таламуса, базалатеральную миндалину, энторинальную кору, клеточный слой Пуркинье мозжечка, вестибулярные ядра, вентральное кохлеарное ядро, моторное ядро тройничного нерва, клиновидное ядро продолговатого мозга (Weaver D.R., et al., 1995).

Установлено, что активные точки экспрессии гена ПТГрП представляют собой нейронные популяции, которые имеют ряд общих черт, включая высокую экспрессию возбуждающих аминокислотных рецепторов высокой плотности и восприимчивость к эксцитотоксичности. Широкое распространение ПТГрП и рецептора ПТГ/ПТГрП в головном мозге предполагает, что ПТГрП выполняетет определенные функции в головном мозге и может иметь разные физиологические роли через различные рецепторы (Weaver D.R. et al., 1995). Установлено, что ПТГрП участвует в регуляции церебрального кровотока и оказывает нейропротективный эффект.(Macica C.M., Broadus A.E. et al., 2003).

Имеются сообщения, показывающие, что в ЦНС крысы, в мозговых оболочках выявлена иммунореактивность для ПТГрП, который связывается с высоким сродством с рецептором ПТГ/ПТГрП. Соответственно, иммунореактивность обнаружена в культивируемых менингеальных клетках (Struckhoff G., Turzynski A., 1995). Экспрессия функционального рецептора ПТГ/ПТГрП в обнаружена в человеческих мозжечковых нейронах (Eggenberger M., et al., 1996) и в астроцитах крыс (Hashimoto H., et al., 1994). Астроциты, но не менингеальные клетки синтезируют мРНК для рецептора ПТГрП. Экспрессия рецептора ПТГ/ПТГрП была подтверждена дозозависимой активацией аденилатциклазы в астроцитах и быстрым развитием клеточных процессов после инкубации с ПТГрП. (Struckhoff G., Turzynski A., 1995).

Таким образом, ПТГрП, действуя через рецептор, может функционировать аутокринно или паракринно в ЦНС. Установлено, что ПТГрП может стимулировать пролиферацию нейронных стволовых клеток через интракринный путь. Снижение клеточной пролиферативной способности в нескольких тканях, включая клетки костного мозга, было связано с измененной экспрессией и субклеточным распределением связанных с старением опухолевых супрессорных белков p16, p21 и p27 и онкогенов Cyclin D, pRb и Bmi-1 у мышей с отсутствием ПТГрП-NLS и C-домена (MiaoD., et al., 2008). Shankar P.P. et al., (2000) показали, что ПТГрП экспрессируется трансформированными и эмбриональными астроцитами человека и ингибирует пролиферацию клеток. Авторы предположили, что экспрессия ПТГрП может быть маркером дедифференцировки и/или злокачественной трансформации в глиальных клетках. Для проверки этой гипотезы, конститутивную и регулируемую экспрессию ПТГрП исследовали в культивируемых плодных и трансформированных (U-373 MG) человеческих астроцитах. Фактор эпидермального роста и фактор некроза опухоли, важные факторы роста развития астроцитов и злокачественной трансформации, стимулировали экспрессию ПТГрП в обоих типах клеток. Обработка клеток U-373 MG или эмбриональных астроцитов с помощью ПТГрП (1-34) последовательно ингибировала клеточную пролиферацию, измеренную путем включения [(3) H]-тимидина. Эти данные свидетельствуют о том, что ПТГрП, экспрессия которого индуцируется митогенами как у незрелых, так и трансформированных астроцитов человека, может по принципу обратной связи ингибировать клеточную пролиферацию. Это может иметь важное значение во время злокачественной трансформации, а также развития ЦНС. Кроме того, в сочетании с предыдущими доказательствами экспрессии ПТГрП с помощью рецептор-позитивных нейронов, демонстрация экспрессии ПТГрП регулируемой рецептор-положительными астроцитами идентифицирует ПТГрП как потенциальный медиатор перекрестных взаимодействий между глиальными клетками и нейронами. Высокие уровни ПТГрП в глиальных опухолях коррелируют с плохим прогнозом (Pardo F.S. et al., 2004). Роль ПТГрП в урогипофизе, который расположен в каудальном отделе спинного мозга костистых рыб (у хрящевых он отсутствует) была исследована Ingleton P.M. et al. (2002). Каудальная нейросекреторная система камбалы (Platichthys flesus) состоит из крупных нейронов (клеток Дальгрена), расположенных в спинном мозге, и урогипофиза, который является нейрогемальным органом (Арнольд-Reed et al., 1991). Аксоны клеток Дальгрена распространяются по нервным структурам до урогипофиза, где они контактируют с базальными мембранами или клетками плотной капиллярной сети. Нейросекреторные клетки Дальгрена вырабатывают гормон, подобный окситоцину, который участвует в осморегуляции. Кроме того, под влиянием гормона урогипофиза происходит сокращение пузыря рыб. Здесь также найдены вещества, вызывающие изменение артериального давления. Установлено, что каудальная нейросекреторная система камбалы может быть вовлечена в контроль ионов кальция через секрецию ПТГрП и должна быть включена в нервные ткани центральной нервной системы, производящие кальцитропные факторы (Hull et al., 1998). В недавнем исследовании, проведенном в Шанхайском университете совместно с исследователями университета Манчестера (Lu W. et al., 1917), были получены данные о молекулярных характеристиках и экспрессия ПТГрП в каудальной нейросекреторной системе эвригалиновой камбалы Platichthys flesus, которые позволили рассматривать эту систему в качестве одного из основных источников ПТГрП у рыб. Урогипофизэктомия подтвердила вероятный вклад каудальной нейросекреторной системе в циркуляцию ПТГрП. Кроме того основными сайтами экспрессии ПТГрП у камбалы являются также кости и мочевой пузырь. Полученные данные рассматриваются как подтверждение консервативной эволюционной роли ПТГрП в эндокринной регуляции кальция у рыб.

Интересно, что астроциты и глиальные клетки млекопитающих содержат ПТГрП (Chattopadhyay et al., 2000) и, кроме того, клеточные процессы астроцитов группируются вокруг капилляров и, по-видимому, участвуют в обмене веществ между капилляром и астроцитом. Эта функция, похоже, подобна функции клеток Дальгрена в каудальной нейросекреторной системе рыб. Астроциты центральной нервной системы млекопитающих считаются поддерживающими клетками и не имеют нейротрансмиттерной функции. Колокализация ПТГрП и кальций-чувствительного рецептора, предполагает, что синтез и/или секреция ПТГрП клетками Дальгрена могут частично контролироваться ионами кальция, как это происходит в астроцитах млекопитающих (Chattopadhyay et al., 2000).

Gu Z. et al., (2012) исследовалили роль последовательности ядерной локализаци (NLS) и C-домена ПТГрП в развитии и функционировании мозга. Исследование функциональной роли последовательности ядерной локализации ПТГрП in vivo, проводили с использованием мышей, которые экспрессируют ПТГрП (1-84). В этой усеченной форме ПТГрП, отсутствуют NLS и C-терминальная области, но сохранена способность взаимодействовать с рецептором клеточной поверхности (Miao D., et al., 2008). Результаты показали, что отсутствие последовательности ядерной локализации ПТГрП и С-концевного домена приводит к аномальному развитию мозга и нарушению его функций. Плотность клеток гиппокампа была значительно снижена у мышей экспрессирующих ПТГрП (1-84) по сравнению с мышами без дефицита NLS и C-терминального домена. Кроме того, у мышей с отсутствием NLS и C-терминального домена были выявлены более короткая цельнозернистая ростро-каудальная ось, но большая дорзально-вентральная ось, меньшая обонятельная луковица, резко уменьшенная толщина лобной коры головного мозга и атрофия мозжечка. Эти результаты показали, что отсутствие в структуре ПТГрП последовательности ядерной локализации NLS и C-концевого фрагмента приводит к аномалиям формирования структур и нарушению функций головного мозга.

Отсутствие ПТГрП-пептида ядерной локализации и C-домена увеличивало апоптоз нервных клеток и повышало уровни экспрессии CDKI в гиппокампе, вызывало ингибирование пролиферации нейронных стволовых клеток и индукцию апоптоза нервных клеток путем ингибирования экспрессии CDKI опосредованной через понижающую регуляцию экспрессии онкогена Bmi-1. Дефицит ПТГрП-NLS и C-фрагмента приводит к задержке дифференцировки нейронных стволовых клеток в нейроны, астроциты и олигодендроциты и нарушеннию синаптической передачи в гиппокампе и пластичности. Это предполагет, что NLS и C-домены ПТГрП могут усилить дифференцировку нейронных стволовых клеток в нейроны, астроглиальные клетки и олигодендроциты. Также обнаружено, что снижение пролиферации нейронных стволовых клеток/клеток-предшественников связано с повышением регуляции p16, p21, p27 и p53. Это свидетельствует о том, что ПТГрП-NLS может стимулировать пролиферацию и дифференцировку нейронных стволовых клеток и ингибировать апоптоз нервных клеток путем регуляции ингибиторов циклинзависимой киназы (CDKI), включая p16, p21, p27 и p53. Также экспериментальные данные in vivo демонстрируют, что NLS и C-домен ПТГрП имеют важное значение для развития мозга, и для поддержания нормальной нейрональной синаптической передачи и пластичности нейронов (Gu Z., et al., 2012).

ПТГрП защищает нейроны от индуцируемой глутаматом эксцитотоксичности в клетках мозжечковых гранул. Эта форма эксцитотоксичности возникает в результате активации зависимых от напряжения кальциевых каналов глутаматными рецепторами класса каината. Активация зависимых от напряжения кальциевых каналов заметно увеличивает экспрессию ПТГрП (Holt E.H. et al., 1996], который, в свою очередь, ингибирует проникновение кальция и способствует выживанию нейронов. Выявлено зависящее от возраста снижение количества нейронов у мышей с гомозиготной делецией гена ПТГрП, особенно в коре головного мозга и гиппокампе (Brines M.L., et al., 1999). ПТГрП локализуется в паравентрикулярных (PVN) и супраоптических ядрах (SON), популяции нейронов, которые синтезируют аргинин-вазопрессин (AVP) (Weaver D.R. et al., 1995; Yamamoto S. et al., 2002). Аксональные проекции от PVN и SON заканчиваются в заднем гипофизе, где AVP высвобождается в ответ на изменения осмоляльности и объема плазмы, что свидетельствует о причастности ПТГрП к нейроэндокринной осморегуляции. В ответ на эти изменения AVP стимулирует реабсорбцию почками воды и оказывает вазоконстрикторное действие. Центральное введение ПТГрП приводит к секреции и экспрессии AVP из PVN и SON (Yamamoto S. et al., 1997). Экспрессия AVP и ПТГрП также взаимно регулируется в диссоциированных культурах нейронов SON. ПТГрП-(1-34) индуцировал высвобождении аргинин- вазопрессина из супраоптического ядра крысы (SON) зависимым от концентрации образом. Ни ПТГрП (7-34), ни ПТГ (1-34) не влияли на высвобождение AVP из ядер гипоталамуса. ПТГрП (1-34)-индуцированное высвобождение AVP было блокировано большим избытком ПТГрП-(7-34) и H89, ингибитором cAMP-зависимой протеинкиназы (A-киназы), но не ПТГ (1-34) или ПТГ (13-34). ПТГрП (1-34), но не ПТГ (1-34), также дозозависимо увеличивали уровни цАМФ в клетках супраоптических ядер (Yamamoto S. et al., 2002). ПТГрП стимулирует внутриклеточное накопление цАМФ в нейронных клетках SON и секрецию AVP в зависимости от протеин-киназы А. Однако неспособность ПТГ (1-34) оказывать какое-либо влияние на секрецию AVP предполагает, что ПТГрП действует через новый подтип рецептора аденилатциклазы в нейронных клетках SON. Напротив, ПТГрП-индуцированная стимуляция секреции AVP является протеинкиназа C-зависимой и опосредуется с помощью AVP-рецептора 1-го типа (V1a и V1b), которые соединяются с сигналами фосфолипазы и образованием 1,4,5-трифосфата инозитола и диацилглицерина (Yamamoto S. et al., 2002). Таким образом, три лиганда и, по меньшей мере, два рецептора семейства генов ПТГ/ПТГрП экспрессируются в ЦНС. Два лиганда (ПТГ и TIP39) экспрессируются в очень дискретных положениях, тогда как ПТГрП широко экспрессируется в популяциях нейронов во всем мозге. ПТГрП-(1-34) индуцирует высвобождение вазопрессина из супраоптического ядра крысы in vitro через новый рецептор, отличающийся от рецептора ПТГ/ПТГрП типа I или типа II (Yamamoto S., et al., 1997).

В экспериментальных исследованиях (Funk J.L., et al., 2001) изучалась возможность индукции ПТГрП в реактивных астроцитах воспаленного мозга. Экспрессия была исследована после воспроизведения кортикальной раны у крыс – классической модели реактивного глиоза. Нейроны были основным сайтом иммунореактивной экспрессии ПТГрП в поврежденной коре в 1-й день после моделирования раны. В течение последующих 3 дней специфическое иммуноокрашивание для ПТГрП и для GFAP, маркера реактивных астроцитов, проявлялось в реактивных астроцитах на краю раны и в периваскулярных астроцитах, достигая максимального уровня экспрессии в 4-й день. Также в опытах in vitro TNF-α индуцировал экспрессию ПТГрП в астроцитах и глиальных клетках мозга, что указывает на то, что этот провоспалительный пептид является возможным медиатором экспрессии ПТГрП при воспалении ЦНС. ПТГрП (1-34) действовал аддитивным образом с TNF-α индуцированной экспрессией астроцитами IL-6, цитокином с установленными нейропротекторными эффектами. Пролиферацию астроцитов ингибировали ПТГрП (1-34) и ПТГрП (1-141), действуя через сигнальный путь цАМФ ПТГ/ПТГрП-рецептора. Эти исследования показывают, что ПТГрП, может быть важным медиатором воспалительной реакции в головном мозге и, возможно, играет в нем защитную роль (Funk J.L., et al., 2001).

Повышенная экспрессия ПТГрП в ЦНС была зафиксирована в реактивных астроцитах, сформированных в ответ на экспериментальную травму мозга (Funk J.L., et al., 2001). В этой связи предполагалась возможность обнаружить повышенную экспрессию ПТГрП в реактивных астроцитах в инфарктной полутени в ответ на ишемию ЦНС. Вместо этого было обнаружено, что сосудистая сеть поврежденного полушария, а не реактивные астроциты, является участком повышенного иммунореактивного ПТГрП в течение первых 24 ч после окклюзии средней церебральной артерии. Сосудистые эндотелиальные клетки оказались источником повышенного иммунореактивного ПТГрП в сосудистой сети ишемизированного мозга, что свидетельствует об индуцировании экспрессия гена ПТГрП в головном мозге в ответ на фокальную ишемию (Funk J.L., et al., 2003). Экспрессия ПТГрП индуцировалась в ишемическом полушарии уже через 4 часа после окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) и оставалась повышенной до 24 часов после этого. Повышенный уровень иммунореактивного ПТГрП в ишемизированной ткани выявлялся в церебральных микрососудах. Инфузия ПТГрП (1-34) увеличивала диаметр артериальных сосудов на 30 % у нормальных животных. У животных с MCAO введение пептидного фрагмента ПТГрП (1-34) значительно уменьшало размер кортикального инфаркта (–47 %). Таким образом, экспрессия ПТГрП увеличивается в участках ишемического повреждения головного мозга. Это местное увеличение ПТГрП может быть адаптивным ответом, который увеличивает приток крови к ишемическому мозгу, таким образом, ограничивая повреждение клеток.

Это увеличение ПТГрП в сосудистом русле может быть результатом локального увеличения экспрессии гена, так как уровни мРНК ПТГрП были увеличены в ишемизированном полушарии в течение того же периода времени. Кроме того данные о положительном артериовенозном градиенте ПТГрП через ишемизированный мозг предполагают возможность того, что поглощение этого белка из кровотока может также способствовать увеличению ПТГрП, продемонстрированного позже в ишемическом мозге (Reichlin S.R., et al., 2000; Somogyvari-Vigh A., et al., 2000).

Индукции РНК ПТГрП в ишемизированном полушарии мозга предшествовала индукция мРНК TNF-α и мРНК IL-1β, двух цитокинов, которые продемонстрировали индукцию экспрессии ПТГрП в других моделях воспаления in vivo и in vitro, включая эндотоксемию и стимуляцию цитокинами эндотелиальных клеток и астроцитов (Eto M., et al., 1998; Ferguson J.E., et al., 1995; Funk J.L., et al., 1993; Shankar P.S., et al., 2000). Таким образом, эти данные согласуются с постулатом, согласно которому TNF-α и/или IL-1β могут также опосредовать экспрессию ПТГрП, вызванную ишемией, в головном мозге. Аналогичным образом, поскольку ПТГрП может индуцировать экспрессию IL-6 в многих типах клеток, включая глиальные (Funk J.L., et al., 1998; Funk J.L., et al., 2001), замедленная экспрессия IL-6, обнаруженная в ишемическом мозге, также может быть связана с локальным увеличением ПТГрП. Во все исследованные моменты времени мРНК рецептора ПТГ/ПТГрП (PTH1R) экспрессировалась в ишемическом полушарии, хотя во время максимальной индукции ПТГрП (24 ч) уровни экспрессии ПТГ/ПТГрП-рецептора были уменьшены. Эта регуляторная взаимосвязь ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептора, согласующаяся с хорошо описанной способностью ПТГрП подавлять экспрессию своего рецептора (Soifer N.E., et al., 1993), дает дополнительное доказательство биологического эффекта локально усиленной экспрессии ПТГрП в ишемизированном мозге.

Выявление повышенной иммунореактивности ПТГрП в микроциркуляторном русле ишемического мозга, позволило предположить, что одним из возможных защитных эффектов этого вазоактивного пептида во время инсульта может быть усиление мозгового кровотока. Установлено, что суперфузия микроциркуляторных пиальных сосудов с ПТГрП (1-34) сопровождалась увеличением диаметра артериол на 30 % (Funk J.L., et al., 2003). Согласно уравнению Пуазейля, где поток пропорционален четвертой степени радиуса сосуда, это 30 % увеличение диаметра артериол может привести к тройному увеличению кровотока в условиях постоянного давления. Поскольку более мелкие терминальные артерии, сильно влияют на цереброваскулярную резистентность и кровоток (Harper S.L., et al., 1984), ПТГрП может поэтому играть критическую роль в поддержании цереброваскулярного кровотока. Более того, поскольку сосудистые реакции пиальных артериол сходны с церебральным кровообращением в целом и из-за параллельного изменения диаметра сосудов артерии в региональном кровотоке, эти данные свидетельствуют о том, что индуцированный ишемией ПТГрП в микрососудах в областях ишемии мозга может служить для усиления мозгового кровотока в поврежденной коре (Funk J.L., et al., 2003).

Huang M. et al. (1983) продемонстрировали, что ПТГ (1-34) увеличивал образование цАМФ в церебральных микрососудах ex vivo. Предполагается, что сосудорасширяющие эффекты ПТГрП (1-34) могут быть опосредованы при участии аденилациклазного сигнального пути (Funk J.L., et al., 2003). В соответствии с этой гипотезой и с доказанной ролью цАМФ в опосредовании вазодилатации ПТГрП (1-34) в сосудов, не относящихся к ЦНС (Massfelder T., et al., 1995), суперфузия пиальных артериол пептидом ПТГ (3-34), который связывается с ПТГ/ПТГрП-рецептором, но не стимулирует образование цАМФ, не влияла на диаметр артериол.

Поскольку паренхиматозные и пиальные артериолы аналогично реагируют на вазоактивные стимулы, эти данные свидетельствуют о том, что устойчивое увеличение ПТГрП в церебральной микроциркуляции, такое как при ишемии, может быть связано с устойчивым увеличением диаметра тех микрососудов, которые регулируют местный кровоток. Обнаружение защитного эффекта введения ПТГрП (1-34) при ограничении размера кортикального инфаркта согласуется с гипотезой о том, что эндогенно продуцируемый ПТГрП также обладает защитным действием в ишемическом мозге. Изолированный защитный эффект введения ПТГрП (1-34), уменьшающий размер инфаркта предполагает, что этот сосудорасширяющий пептид является нейропротективным в тех областях головного мозга, повреждение которых может быть легко устранимым за счет увеличения кровотока (Funk J.L., et al., 2003). Эти данные, свидетельствуют об увеличении экспрессии гена локального сосудистого ПТГрП в ишемическом мозге, а также способности NH2 -домена ПТГрП действовать в качестве мощного сосудорасширяющего средства в пиальной микроциркуляции и уменьшать размер кортикального инфаркта почти на 50 % (Funk J.L., et al., 2003). Дополнительные исследования необходимы для выявления всех возможных мишеней ПТГрП в ЦНС во время ишемии, так как ПТГрП в дополнение к сосудорасширяющим эффектам также оказывает прямое защитное воздействие на нейроны и индуцирует глиальную экспрессию нейропротекторных цитокинов (Brines M.L., et al., 1999; Funk J.L., et al., 2001; Ono T., et al., 1997). Положительный эффект ПТГрП на развитие кортикального инфаркта согласуется с гипотезой о том, что эндогенные увеличения церебрального ПТГрП могут служить для защиты мозга при ишемии, сохраняя мозговой кровоток. Более того, защитный эффект экзогенно вводимого ПТГрП (1-34), продемонстрированный в клинических испытаниях для лечения остеопороза (Horowitz M.J., et al., 2002) позволил предположить (Funk J.L., et al., 2003), что этот пептид также может быть полезен при острых терапевтических вмешательствах, направленных на улучшение клинических результатов у пациентов, страдающих от инсульта.