Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

10.6.1. Паратгормон-родственный белок и рак легкого

Впервые о выделении нового биологически активного протеина сообщили Moseley J.M. et al. (1987). Белок с биологической активностью, подобной паратиреоидному гормону, был очищен из культуральной среды, полученной из клеточной линии рака легких человека. Анализ аминокислотной последовательности материала, очищенного с помощью ВЭЖХ, показал, что 8 из 16 аминокислотных остатков были идентичны 8 аминокислотным остаткам ПТГ человека. ПТГрП, является аутокринным и паракринным фактором, идентифицированным как продукт опухолей человека, включая все основные типы клеток рака легких (Brandt et al., 1991).

ПТГрП оказывает влияние на пролиферацию клеток, апоптоз, подвижность и инвазию, процессы, которые способствуют агрессивным характеристикам злокачественных новообразований и изменяют склонность к метастатическому раку (Курзанов А.Н. и соавт., 2016; Медведев В.Л. и соавт., 2017; Бизенкова М.Н., Курзанов А.Н., 2017). Эти эффекты варьируют в зависимости от типа рака и контекста и могут альтернативно увеличивать или уменьшать злокачественный фенотип. Hastings R.H. et al. (2001) продемонстрировали, что ПТГрП обладает аутокринными эффектами в снижении роста карциномы легких у мышей.

ПТГрП продуцируется примерно в двух третях случаев человеческих немелкоклеточных карцином легких(НМРЛ), может играть роль в прогрессировании опухоли или прогнозе этого заболевания и он связан с более длительной выживаемостью у пациентов с НМРЛ (Hastings R.H., et al., 2006). Экспрессия белка может иметь последствия для прогрессирования заболевания, поскольку он регулирует рост раковых клеток, апоптоз и ангиогенез. Однако его связь с выживаемостью не была оценена. Экспрессию ПТГрП оценивали в образцах опухоли у 407 пациентов с НМРЛ с помощью иммуногистохимии. Средняя выживаемость составила 55 против 22 месяцев у женщин с опухолями продуцирующими ПТГрП и не продуцирующими этот белок соответственно. Выживаемость мужчин составлила 38 месяцев независимо от ПТГрП-статуса новообразования. ПТГрП оставался значимым предиктором выживаемости для женщин-пациентов после контроля на стадию, гистологию и возраст.

Механизмы, посредством которых ПТГрП может участвовать в регуляции прогрессирования рака легких, не установлены. ПТГрП (1-34) вызывает снижение пролиферации клеток, плоскоклеточной линии карциномы легкого BEN, дозозависимым образом (Hastings R.H. et al., 2001). ПТГрП замедляет прогрессирование карциномы легких и модифицирует результат у пациентов с раком легких. Введение мышам с ПТГрП-экспрессирующими ортотопическими карциномами легких, нейтрализующих антител против ПТГрП (1-34) (Hastings R.H. et al., 2001) уменьшило уровни ПТГрП опухоли и ускоряло рост опухоли, свидетельствуя, что ПТГрП, продуцируемый карциномой, сдерживал ее рост. Обнаружено, что женщины с карциномами легких, которые продуцировали ПТГрП, жили в среднем на 3 года больше, чем женщины, у которых опухоли не продуцировали белок (Hastings R.H. et al., 2006).

Hastings R.H., et al. (2009) исследовали влияние экспрессии ПТГрП на пролиферацию и прогрессирование клеточного цикла двух клеточных линий аденокарциномы легких человека, которые обычно являются ПТГрП-отрицательными. Стабильная трансфекция с ПТГрП уменьшала синтез ДНК клетками линии H1944. Рост значительной части ПТГрП-положительных клеток была задержан или медленно прогрессировал. Уровни белков- регуляторов циклинзависимых киназ Cyclin D2 и cyclin A2 были на 60–70 % ниже в клетках, экспрессирующих ПТГрП, по сравнению с контрольными клетками, тогда как экспрессия белка ингибитора клеточного цикла p27 (Kip1), циклинзависимого ингибитора киназы, была в присутствии ПТГрП существенно увеличена. ПТГрП не изменял состояние фосфорилирования белка-супрессора опухолей Rb, а уменьшал образование циклинзависимой киназы CDK 2. Эктопическая экспрессия ПТГрП стимулировала фосфорилирование митоген-активированных киназ семейства регулируемых киназ внеклеточного сигнала ERK регулирующих процессы пролиферация и клеточной дифференциации. В клетках линии MV522 ПТГрП оказывал сходное влияние на синтез ДНК, экспрессию циклина A2, уровни протеина Rb, ассоциацию CDK2-cyclin A2 и активацию ERK. Таким образом, ПТГрП, по-видимому, замедляет прогрессирование клеток рака легких в S-фазу, возможно, путем уменьшения активации CDK2. В целом, это исследование демонстрирует, что стабильная экспрессия ПТГрП ингибирует рост двух различных клеточных линий карциномы легких. Ингибирование роста связано с уменьшением экспрессии циклина D2 и циклина A2, повышенной экспрессией p27, уменьшением ассоциации циклина A2 и CDK2 и повышенной активацией ERK. Изменения в циклинах и р27 оказались посттранскрипционными, потому что транскрипты не изменялись, в то время как изменение уровней белка имело место. Последствием опосредованных ПТГрП ингибиторных эффектов может быть более медленная пролиферация раковых клеток, что может способствовать замедлению прогрессирования опухоли и увеличению выживаемости пациентов с ПТГрП-положительным раком легкого по сравнению с ПТГрП-негативными карциномами легких. Результаты настоящего исследования дают объяснение предыдущим выводам о росте и выживаемости опухоли. Более медленная пролиферация в присутствии ПТГрП может служить объяснением более медленного роста ПТГрП-положительных карцином легкого. В свою очередь, более медленное прогрессирование опухоли может способствовать увеличению выживаемости пациентов, карциномы которых продуцируют ПТГрП. Таким образом, присутствие ПТГрП, по-видимому, взаимосвязано с более медленным прогрессированием карциномы легкого и более длительной выживаемостью больных.

ПТГрП экспрессируется в значительном большинстве случаев рака легких и играет ключевую роль в прогрессировании опухоли. Таким образом, этот онкопротеин может быть мишенью для лечения пациентов с раком легких. Hastings R.H., et al. (2010) скринировали комбинаторные библиотеки гетероциклических аминов для ингибирующего воздействия на экспрессию ПТГрП и пролиферацию клеток. Две библиотеки из более чем 780 000 бис-циклических соединений тиомочевины и соединений гуанидина были протестированы в клетках карциномы легких BEN. Количество ингибиторов ПТГрП и величина уменьшения ПТГрП были выше для тиомочевины. Выбранные соединения тиомочевины уменьшали содержание белка ПТГрП в клетке дозозависимым образом, уменьшали относительное содержание мРНК ПТГрП, уменьшали транскрипты, полученные из промотора ПТГрП P3, и снижали активность люциферазы ПТГрП-промотора. Аналогичные эффекты на мРНК PTHrP наблюдались в клетках аденокарциномы легких линий A549 и H441 и в карциноидных клетках легких линии H727. Однако соединения только ингибировали уровни белка ПТГрП в клетках BEN и клетках H727. Соединения снижали скорость пролиферации клеток в клетках BEN и клетках H727, но не в линиях, которые не ингибировали белок ПТГрП. Эти результаты показывают, что циклические соединения тиомочевины ингибируют экспрессию ПТГрП, опосредованную промотором P3, которая широко используется в большинстве клеток, экспрессирующих ПТГрП, и что они могут ингибировать рост клеток рака легких через тот же механизм.

Три зрелых пептида с различными COOH-концевыми областями, ПТГрП (1-139), ПТГрП (1-173) и ПТГрП (1-141), транслируются из трех разных мРНК посредством альтернативного сплайсинга. В каждом случае COOH-концевой фрагмент (C-ПТГрП) является стабильным и измеримым в моче. Nishigaki Y. et al. (1999) измерили концентрации в крови и моче C-ПТГрП у 28 пациентов с первичным раком легкого и нормальным уровнем кальция в сыворотке. Показано, что экспрессия мРНК всех форм ПТГрП выявляется при раке легкого. Обнаружено, что уровни C-ПТГрП в сыворотке и моче у пациентов с НМРЛ были значительно выше, чем у обычных пациентов. Авторы предположили, что ПТГрП, вероятно, играет роль, сходную с фактором роста или фактором пролиферации при раке легкого, особенно НМРЛ, на уровне, недостаточном для возникновения гуморальной гиперкальциемии злокачественности.

Экспрессия карбоксильного домена ПТГрП является положительным прогностическим показателем у женщин с раком легких, но присутствие N-концевого фрагмента ПТГрП предиктор худшего прогноза прогрессирования заболевания и выживаемости пациентов с раком легких (Hastings R.H., et al., 2017).

При немелкоклеточном раке легкого, экспрессия ПТГрП предсказывает более длительную выживаемость у женщин, но не у мужчин. Чтобы объяснить эффект выживания, зависящий от пола, Montgrain P.R., et al. (2007) предположили, что гормональные влияния уменьшали ПТГрП у мужчин в сравнении с женщинами, а также, что ПТГрП ингибирует рост опухоли и эффект у женщин выше, чем у мужчин. Целью этого исследования было сравнить экспрессию ПТГрП карциномы легких и рост карциномы у мышей мужского и женского пола и определить, регулируют ли половые стероиды ПТГрП в клетках рака легких. Карциномы легких содержали примерно в 3 раза больше ПТГрП у самок мышей, чем у самцов мышей. Аналогично, уровни мРНК ПТГрП были значительно выше при аденокарциномах у пациентов женщин, чем у пациентов, мужчин. Карциномы легких у самок мышей продуцировали ПТГрП больше, чем у самцов, возможно, из-за отрицательной регуляции андрогенами у мужчин. У мышей самок с более высоким содержанием ПТГрП в опухоли было значительно меньше нагрузки на опухоль, чем у самцов мышей, что подтвердило гипотезу о том, что ПТГрП ингибирует рост опухоли.

Вышеприведенные данные свидетельствуют о зависимости присутствия ПТГрП у больных немелкоклеточной карциномы легкого с повышенной выживаемостью у женщин, но не у мужчин. В последующем исследовании авторы из той же лаборатории попытались обосновать этот вывод в двух новых группах пациентов (Montgrain P.R. et al., 2011). ПТГрП присутствовал у 70–80 % пациентов, независимо от пола, стадии и истории заболевания. У женщин с раком легкого I стадии ПТГрП-позитивность увеличивала медианную выживаемость от 25 до 60 месяцев. Во второй группе экспрессия ПТГрП увеличила 48-месячную безболезненную выживаемость женщин с раком легких с 44 % до 63 %, но не имела никакого эффекта у мужчин-пациентов. ПТГрП оставался значительным независимым предиктором при оценке вместе с другими ковариатами по многофакторной регрессии Кокса. Это исследование подтверждает, что ПТГрП является зависимым от пола фактором выживаемости при немелкоклеточной карциноме легкого, что он коррелирует с безрецидивной выживаемостью и что связь с выживаемостью сохраняется у женщин с ранней стадией заболевания. Таким образом, ПТГрП может найти применение в качестве прогностического показателя и может стать целью терапии.

В исследовании сигнальных путей, участвующие в ингибировании ПТГрП-зависимого роста опухолевых клеток Montgrain P.R. et al. (2015) использовали нокдаун рецептора ПТГ/ПТГрП (PTH1R) для установления его роли в ограничении пролиферации клеток. Рецепторный нокдаун отменил способность экзогенного ПТГрП (1-34) ингибировать пролиферацию клеток H1944, а также устранил разницу в скорости роста между ПТГрП-положительными и трансформированными клетками рака легкого линии H1944. В итоге в этом исследовании были изучены механизмы сигнализации через которые ПТГрП ингибирует пролиферацию клеток рака легких посредством взаимодействия с ПТГ/ПТГрП-рецептором. Эффект может быть частично опосредован цAMФ в качестве второго мессенджера.

ПТГрП рассматривался как прогностический фактор для немелкоклеточного рака легкого, но результаты были противоречивыми. Wu CE., et al. (2015) исследовали роль цитоплазматического и ядерного ПТГрП у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, которые подверглись хирургической лечению. Пациенты с высокой экспрессией цитоплазматического ПТГрП имели значительно более неблагоприятный прогноз как в случае безрецидивной выживаемости, так и общей выживаемости. Напротив, пациенты с высокой экспрессией нуклеарного ПТГрП, имели благоприятный прогноз выживаемости без рецидива заболевания и значительно более высокую общую выживаемость. Не было никакой корреляции между экспрессией цитоплазматического и ядерного ПТГрП. Кроме того, многофакторный анализ с использованием регрессионной модели Кокса подтвердил, что высокая экспрессия цитоплазматического ПТГрП и нуклеарного ПТГрП были независимо прогностическими факторами безрецидивной и общей выживаемости. Цитоплазматический и ядерный ПТГрП играют противоположную прогностическую роль для безрецидивной и общей выживаемости пациентов с ранним немелкоклеточным раком легкого, которые подверглись лечебной резекции.

Farach-Carson M.C., et al. (2017) представили систематический обзор с использованием баз данных EMBASE и Pubmed обобщающий результаты более 90 статей, чтобы охарактеризовать потенциальные механизмы, с помощью которых различия в половой принадлежности и уровне половых гормонов влияют на формирование метастазов в кости. Авторы проанализировали как базовые, так и клинические исследования с 1994 по 2017 годы, в которых основное внимание уделялось механизму и частоте метастазов в кости наиболее распространенных видов рака, которые подвержены влиянию полового диморфизма и уровня половых гормонов, включая рак легких.

Многочисленные исследования показали, что половые стероиды и их рецепторы являются важными механизмами, лежащими в основе половых различий, особенно с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). ПТГрП также может повлиять на формирование метастазов в раке легкого. Модели экспрессии ПТГрП при раке легкого могут включать связанный с полом механизм, который способствует различиям в формировании костных метастазов. ПТГрП продуцирующая опухоль легкого ассоциируется с повышенной выживаемостью у пациентов с НМРЛ в зависимости от пола (Montgrain P.R. et al., 2007). Женщины с опухолями, у которых проявлялась иммунореактивность ПТГрП, имеют лучшую выживаемость, чем женщины с ПТГрП-от-
рицательными опухолями. Этот эффект не наблюдался у мужчин, что свидетельствует о связанном с полом механизме эффекта выживания у женщин (Hastings R.H. et al., 2004; Hastings R.H. et al., 2006). Опухоли легких у самок мышей продуцировали больше ПТГрП, чем у самцов, что возможно, связано с отрицательной регуляцией ПТГрП андрогенами у самцов мышей (Montgrain P.R., et al., 2007). Miki T. et al. (2004) используя нейтрализующие антитела против ПТГрП идентифицировали роль этого протеина в формировании костных метастазов, демонстрируя, что ПТГрП, продуцируемый клетками рака легкого человека линии SBC-5, способствует развитию метастазов в кости, но не висцеральных метастазов. Роль пола была исследована с использованием той же клеточной модели в более поздней работе Sakaguchi S. et al. (2010), которые зафиксировали, что метастазы рака легкого формировались почти вдвое чаще у самцов мышей с опухолями, которые экспрессируют ПТГрП и эстрогеновый рецептор β, что еще раз свидетельствуют о потенциальной роли феминизированного костного мозга в поддержке роста метастазов рака легкого в костной ткани. Эти результаты показывают, что баланс половых стероидов и паракринных регуляторных факторов, включая ПТГрП, играет важную роль в формировании костного метастаза при мелкоклеточном раке легкого и предлагает различные механизмы взаимодействия между раковыми клетками и клетками-хозяевами в микроокружении кости.

MicroRNA-33a функционирует как супрессивный ингибитор костных метастазов при раке легкого, нацеливаясь на ПТГрП, который стимулирует остеокластическую резорбции кости. Авторы обнаружили, что уровни miR-33a отрицательно коррелируют с экспрессией ПТГрП клетками линии рака легких A549. Перепроизводство miR-33a снижает стимулирующий эффект A549 на продукцию активатора остеокластогенеза RANKL (активатор рецептора каппа-лиганда ядерного фактора) и M-CSF (фактор роста колоний макрофагов) на остеобластах. Сверхэкспрессия miR-33a снижает также ингибирующую активность A549 на продукцию ингибитора остеокластогенеза остеопротегерина, а также умешает экспрессию ПТГрП в клетках линии рака легких. Кроме того, miR-33a-опосредуемая ПТГрП-регуляция приводит к уменьшению секреции IL-8 в клетках A549, что снижает индуцируемую раком дифференцировку остеокластов и резорбцию кости. Эти результаты позволили заключить, что miR-33a может быть мощным супрессором костных метастазов опухоли, который ингибирует прямой и косвенный остеокластогенез посредством репрессии ПТГрП.

Установлено, что препараты первой линия химиотерапии местно-распространенного или метастатического (IIIB-IV стадии) немелкоклеточного рака легкого с активирующими мутациями в гене рецептора эпидермального фактора роста также приводят к подавлению продукции ПТГрП. Furugaki K. et al. (2011) продемонстрировали, что эрлотиниб, ингибитор тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста, ингибирует остеолитическую инвазию опухолей при костном метастазировании, вызванную клетками рака легких, благодаря ее влиянию на продукцию RANKL остеобластами, а также подавление продукцию остеолитических факторов, включая продукцию ПТГрП. Lorch G. et al. (2007) оценилии экспрессию ПТГрП и состояние гиперкальциемии в рандомизированном контролируемом исследовании, в котором, бестимусные мыши с ксенотрансплантатами карциномы плоскоклеточного рака человека линий RWGT2 и HARA получали либо плацебо, либо ингибитор протеинтирозинкиназы гефитиниб – препарат для лечения местнораспространенного или метастатического немелкоклеточного рака легкого, устойчивого к химиотерапии. Эффективность терапии оценивали путем измерения плазменного кальция и ПТГрП. Экспрессия гена ПТГрП в обеих линиях была снижена на 40–80 % после лечения ингибитором тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста гефитинибом.

Метастазы костей при раке легкого – это завершение сложной последовательности клеточно-биологических событий, в которых участвуют множественные взаимодействия раковых клеток с вмещающими клеточными и внеклеточными микроэлементами хозяина, а также различные типы молекул, включая цитокины (Uy H.L. et al., 1997), молекулы адгезии, гормоны (Miki T. et al., 2004) и хемокины (Cai Z. et al., 2009). Распространено мнение, что ПТГрП может быть одним из уникальных регуляторных факторов, участвующих в костном метастазировании рака легких (Miki T. et al., 2004). Положительная экспрессия ПТГрП при раке легкого обуславливает более высокий шанс развития метастазов в кости. Также показано, что ПТГрП, продуцируемый клетками рака легкого, может индуцировать продукцию RANKL остеобластами, а также уменьшать генерацию остеопростегерина, что приводит к созреванию и активации остеокластов. Антибиотик реверомицин А может ингибировать костное метастазирование путем подавления активности остеокластов, непосредственно индуцируя апоптоз и опосредованно ингибируя продукцию ПТГрП (Muguruma H. et al., 2005). TGF-β также может стимулировать клетки рака легких к сверхэкспрессии ПТГрП и если сигнальный путь TGF-β был подавлен, экспрессия ПТГрП также уменьшалась (Lorch G. et al., 2007).

Deng X., et al. (2007) изучили роль ПТГрП в костном метастазировании карциномы легкого плоскоклеточного рака клеточной линия (HARA) in vivo. ПТГрП (все три изоформы) были повышенными в клетках линии HARA в локусах метастазов в кости. Изоформа мРНК ПТГрП-141 была увеличена в наибольшей степени (в 13,9 раза) при метастазах в кости по сравнению с ПТГрП-139 и мРНК ПТГрП-173. Ингибирование экспрессии ПТГрП интерференцией РНК вызывало значительное уменьшение субмембранного F-актина и снижение инвазии клеток HARA. Идентификация ПТГрП в качестве важных регуляторов метастазирования рака легкого рака дает новые представления о потенциальных целях для профилактики и лечения метастазов рака легкого.

Iguchi H., et al. (1996) моделировали формирование костного метастаза у мышей с использованием клеток карциномы легких человека линии HARA, высокоэкспрессирующих ПТГрП, один из наиболее мощных факторов, способствующих остеокластогенезу. Инъекция клеток HARA в левый желудочек сердца приводила к развитию опухолевых колоний исключительно в скелетной системе. Введение антител против ПТГрП, уменьшило частоту метастазов в кости и объем опухолей после инокуляции клеток HARA. Введение клеток другой линии (QG-56), продуцирующих плоскоклеточную карциному человека в которой ген ПТГрП не экспрессируется, не приводило к метастазированию кости. Эти данные свидетельствуют о том, что ПТГрП играет важную роль в формировании костных метастазов.