Научная электронная библиотека

Функциональные и метаболические эффекты симпато-адреналовой системы и стресс

Тапбергенов С. О., Тапбергенов Т. С., Советов Б. С.,

7.1. Метод определения активности 5`- нуклеотидазы

5`-нуклеотидаза (5›-рибонуклеотидфосфогидролаза, КФ3.1.3.5) – фермент, осуществляющий гидролиз АМФ (аденозин-5-монофосфата) с образованием инозина и фосфорной кислоты. Определение активности данного фермента является более информативным методом диагностики патологии печени по сравнению с щелочной фосфатазой (ЩФ), так как активность 5` нуклеотидазы не изменяется при заболеваниях костей.

5`-нуклеотидаза – фермент, показателен при заболеваниях печени: поражения гепатобиллиарного тракта, желчнокаменная болезнь, рак печени, метастазы в печень, цирроз печени.

Определение активности 5’-нуклеотидазы (5’НТ)

Принцип метода заключается в ферментативном гидролизе АМФ до аденозина и фосфорной кислоты. Активность 5`-нуклеотидазы выражается в количестве мкмоль Н3РО4, образовавшейся в результате гидролиза АМФ за 1 минуту в перерасчете на мг белка взятого биоматериала.

Количество фосфорной кислоты определяется цветной реакцией Фиске-Суббароу с молибденовым реактивом. Расчет производят по калибровочному графику. Белок определяют по методу Лоури.

Реактивы:

1. Буферно-субстратная смесь № 1.

5 мг b-глицерофосфата растворяют в 10 мл О, 2 М р-ре трис-буфера рН 7,5. Трис-буфер с рН 7,5 готовят по обычной схеме. Раствор готовят раз в месяц, хранят в холодильнике. Раствор становится непригодным к работе, в случае, если на его дне образуется осадок.

2. Буферно-субстратная смесь № 2.

10 мг АМФ растворяют в 10 мл трис-буфера (рН 7,5) (раствор держать в холодильнике).

3. 0,2 % раствор аскорбиновой кислоты (готовить перед анализом!)

0,02 г аскорбиновой кислоты – 10 мл дист. воды.

4. Трихлоруксусная кислота (ТХУ) 10 % раствор.

5. Для определения количества фосфорной кислоты используют 2,5 % раствор молибденово-кислого аммония в 5н растворе серной кислоты, который готовится из смеси раствора А (60 мл) и раствора Б (25 мл), доведенные дважды дист. водой до 100 мл.

Раствор А – 2,5 г молибдата аммония (NH4)Mo7O24∙4H2O растворяют в 60 мл дважды дист. воде в мерной колбе на 100 мл;

Раствор Б – К 25 мл дважды дист. воды добавляют 7,5 мл концентрированной H2SO4.

Для работы соединяют оба раствора (А – 60 мл и Б – 25 мл) и охлаждают при комнатной температуре. Смесь доводят до 100 мл дистиллированной водой;

Ход определения активности 5’-нуклеотидазы

Берут 2 пробирки. В первую пробирку (опыт – Оп) и вторую пробирку (контроль – К) вносим по 0,1 мл биоматериала (плазма или сыворотка). В контрольную пробирку (К) – 0,6 мл буферно-субстратной смеси № 1. В пробирку опыт (Оп) добавляют 0,6 мл буферно-субстратной смеси № 2.

Далее проводят инкубацию пробирок в термостате при 37 °С в течение 3-х часов. Вынимают пробирки и останавливают реакцию 10 % ТХУ – по 0,7 мл в обе пробирки. Затем центрифугируют при 2,5 об/мин в течение 10 минут. Из обеих пробирок в чистые пробирки отбирают по 1 мл супернатанта и добавляют по 0,1 мл молибденового реактива и аскорбиновой кислоты.

Для увеличения объема в обе пробирки добавляют по 2 мл дважды дистиллированной воды. Пробирки оставляют на 20 минут при комнатной температуре для развития окраски. Охлаждают под проточной водой и быстро не позднее 5 мин колориметрируют все пробы (окраска не устойчива!).

Колориметрия на ФЭК при длине волны 840 нм, красный светофильтр, в кюветах с толщиной слоя 0,5 см против дист. воды.

Расчет активности фермента

Используя обнаруженные экстинции контроля и опыта по калибровочной кривой находят количество мкмолей фосфата образовавшегося при гидролизе АМФ. Поскольку полученные результаты могли быть завышены за счет неспецифического гидролиза АМФ щелочной фосфатазой, из активности фермента (пробирка ОП), измеренной по отношению к этому субстрату (специфическая активность), высчитывают активность измеренная (пробирка К) по отношению к b-глицерофосфату, которая практически близка к нулю.

И далее по формуле производят перерасчет на мг белка на 180 мин инкубации:

01.wmf