Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

1.2.2.1. Структурно-фукциональные характеристики рецептора PTH2R

На уровне аминокислотной последовательности этот рецептор на 51 % идентичен человеческому рецептору PTH1R и сходство по меньшей мере на 30 % аминокислотной последовательности с другими рецепторами гормонов, принадлежащими к подсемейству B1-рецепторов (Usdin T.B. et al., 1995). PTH2R рыбок данио очень похож на PTH2R крысы (Rubin et al., 1999), Человеческий PTHR2 реагирует на ПТГ, но не на ПТГрП, тогда как крысиный PTHR2 не взаимодействует ни с ПТГ, ни с ПТГрП (Hoare S.R. et al., 1999;. Tenne M. et al., 2008; Usdin T.B. et al., 1995). Это подтверждает, что эндогенным лигандом для PTH2R является не ПТГ или ПТГрП, а другой отдельный пептид. Клонирование PTH2R вызвало поиск пептидного лиганда, который является его естественным агонистом и избирательно активирует PTH2R. Доказательства существования такого лиганда действительно были получены благодаря обнаружению в экстрактах ткани бычьего гипоталамуса белкового фактора, который мог стимулировать PTH2R крысы или человека более эффективно, чем ПТГ или ПТГрП (Usdin T.B., 1997; HoareS.R. et al., 1999). Активный фактор был очищен и секвенирован, и таким образом было показано, что он представляет собой полипептид из 39 аминокислот (Usdin T.B. et al., 1999; Usdin T.B., 2000). Идентифицированная пептидная последовательность имеет только умеренную гомологию с ПТГ и ПТГрП и включает N-концевое удлинение из двух аминокислот. Последовательность поддерживает предсказанную C-концевую амфипатическую α-спираль, и в исследованиях ЯМР в фазе раствора демонстрирует бихелиновую структуру, довольно типичную для семейства лигандов ПТГ и ПТГрП (Piserchio A. et al., 2000).

Gardella T.J. et al. (1996) изучили взаимодействие нескольких гибридных лигандов ПТГ, ПТГрП и других родственных пептидных аналогов с рецептором PTH2R человека. Результаты показали, что два сайта в ПТГ и ПТГрП полностью учитывают разные потенции, которые оба лиганда проявляли с рецепторами PTHR. Структурные детерминанты, которые учитывают способность PTH2R различать ПТГ и ПТГрП, были идентифицированы (Gardella et al., 1996). Гистидин в положении 5 (Ile в ПТГ) и Phe в положении 23 (Trp в ПТГ) определяют дифференциальную аффинность связывания и активацию. Остаток 5 (His в ПТГрП и Ile вПТГ) определяли способность к передаче сигналов, в то время как остаток 23 (Phe в ПТГрП и Trp в ПТГ) определял аффинность связывания. Изменяя эти два остатка ПТГрП на соответствующие остатки ПТГ, оказалось возможным превратить ПТГрП в лиганд, который высокоэффективно связывался с рецептором PTH2R и полностью и сильно стимулировал образование цАМФ. Таким образом, остатки 5 и 23 в ПТГ и ПТГрП играют ключевую роль в сигнальных и связывающих взаимодействиях, соответственно, с рецептором PTH2R. Показано, что высокоаффинное связывание пептидного агониста TIP-39 с рецептором PTH2R требует гидроксильной группы Tyr-318 на трансмембранной спирали 5. Модель комплекса TIP39-PTH2R была построена и проанализирована с использованием молекулярной динамики. Было показано, что гидроксильная группа боковой цепи Tyr-318 играет важную роль для связывания TIP39. Моделирование молекулярной динамики позволило предположить, что селективность основана на взаимодействии гидроксильной группы Tyr-318 рецептора с карбоксилатной боковой цепью Asp-7 пептида (Weaver R.E. et al., 2017).

Обнаруженный пептид, называемый TIP39 (тубероинфундибулярный пептид из 39 аминокислот), индуцирует надежную активацию PTH2R. Это указывает на то, что TIP39 является его нативным лигандом (John M.R. et al., 2002; Usdin T.B. et al., 1999a). Было показано, что TIP39 является нативным лигандом PTH2R у млекопитающих и рыбок данио (Papasani M.R. et al., 2004; Della Penna K. et al., 2003; Usdin T.B. et al., 1999b). TIP39 проявляет сильную селективность в отношении рецепторов, так как он мощно активирует PTH2R, но не активен в отношении PTH1R и связывается с PTH2R с примерно в 20 раз более высокой аффинностью, чем с PTH1R (Hoare S.R. et al., 2000a).

Исследования зависимости активности лигандов от их структуры позволили определить молекулярные детерминанты лиганд-рецепторного взаимодействия для PTH2R. Несмотря на значительную степень сходства между рецептором PTH2R и рецептором PTH1R они существенно отличаются сродством к разным лигандам (Behar V. et al., 1996). Взаимодействие N-концевых остатков любого пептида с юкстамембранным «телом» PTH1R обеспечивает активацию рецептора, а контакт С-концевых пептидных последовательностей с внеклеточным N-концом рецептора существенно способствуют связыванию с высоким сродством (Mannstadt M. et al., 1999). В соответствии с этой моделью, химерный рецептор, состоящий из N-концевого внеклеточного домена PTH1R и остатка (юкстамембранного домена) PTH2R, был полностью активирован TIP39 (Hoare S.R. et al., 2000a). Реципрокный химерный рецептор не активируется TIP39 и связывает лиганд со сродством, эквивалентным сродству PTH1R (Hoare S.R. et al., 2000a). Таким образом, домен юкстамембранного рецептора определяет сигнальную и связывающую селективность TIP39 для PTH2R по сравнению с PTH1R. Удаление шести N-концевых остатков TIP39 устраняет активацию PTH2R и снижает аффинность связывания в 70 раз. Эти данные также согласуются с тем, что остатки, которые одинаковы в TIP39, ПТГ (1–34) и ПТГрП (1–36), находятся в карбоксильной части этих пептидов, области, которая отвечает за связывание рецептора с высоким сродством, в отличие от N-концов, которые имеют решающее значение для активации рецепторов (Hoare S.R. и Usdin T.B., 2001; Juppner H. et al., 1991).

Удаление остатков из аминоконца ПТГ или ПТГрП снижает их способность активировать рецептор PTH1R, в то же время оказывая относительно небольшое влияние на их аффинность связывания. ПТГ (7–34), ПТГрП (7–36) и некоторые аналоги этих пептидов являются антагонистами PTH1R (Gardella T.J. et al., 1996). Как и в случае с лигандами, действующими на PTH1R, делеция N-концевых остатков TIP39 заметно снижает сигнальную активность лиганда на PTH2R, в то же время оказывая относительно умеренное влияние на аффинность связывания PTH2R, так что N-концевые фрагменты, такие как TIP (7–39) и TIP (9–39) проявляют антагонистические свойства в отношении PTH2R (Hoare S.R. et al., 2000a; John M.R. et al., 2002). Интересно, что TIP (7–39) и TIP (9–39) связываются с более высоким сродством к PTH1R, чем TIP39, и усеченные пептиды функционируют как антагонисты PTH1R-специфичности (Hoare S.R., Usdin T.B., 2000; Jonsson K.B. et al., 2001). Такие N-концевые усечения имеют тенденцию изменять селективность связывания, наблюдаемую для TIP (1–39), в том, что они снижают аффинность связывания для PTH2R, но улучшают аффинность для PTH1R, так что TIP (7–39) связывается с PTH1R с аффинностью в двадцать раз большей, чем с PTH2R (Hoare S.R. et al., 2000a; Hoare S.R. and Usdin T.B., 2000). Это увеличение аффинности связывания PTH1R не сопровождается каким-либо увеличением сигнальной активности, и, как следствие, TIP (9–39) и TIP (7–39) функционируют как сильные антагонисты PTH1R и, по крайней мере, столь же эффективны, как классический антагонисты PTH1R на основе фрагмента ПТГ (7–34) (Hoare S.R. et al., 2000a; Hoare S.R. и Usdin T.B., 2000; 2002; Jonsson K.B. et al., 2001). Удаление аминоконцевых остатков из TIP39 действительно снижало его способность активировать PTH2R, но также уменьшало его сродство к PTH2R, так что пептид TIP (7–39), без детектируемой агонистической активности, имел слишком низкое сродство, чтобы его можно было использовать в качестве антагониста PTH2R (Hoare S.R. et al., 2000a).

В поисках новых лигандов, которые могли бы действовать в качестве селективных антагонистов для PTH2R и, таким образом, в конечном счете, могли бы быть полезны при определении биологической роли этого рецептора in vivo. Kuo J., Usdin T.B. (2007) выполнили сайт-направленный поиск мутантов TIP39 по отсутствию сигнальной активности цАМФ на PTH2R. Было разработано несколько мощных и селективных антагонистов PTH2R. В результате исследования был получен аналог TIP (1–39), в котором последовательность Leu-Ala-Asp-Asp в положениях 4–7 заменена последовательностью His-Tyr-Trp-His. Было показано, что новый аналог, названный HYWH-TIP39, является особенно эффективным благодаря его селективности. В культивируемых клетках HYWH-TIP39 полностью блокирует активацию крысиногоPTH2R индуцируемую TIP39 TIP39 и обладает более чем 30-кратной селективностью в отношении PTH2R крысы по сравнению с крысиным PTH1R (Kuo J. and Usdin T.B., 2007).). Таким образом, HYWH-TIP39 действительно показывает профиль селективности антагониста рецептора, противоположный TIP (7–39). Новый аналог потенциально может быть полезен в качестве фармакологического агента, с помощью которого можно исследовать биологическую роль TIP39 и PTH2R.

PTH2R и TIP39экспрессируются в наивысших концентрациях в гипоталамусе и спинном мозге у млекопитающих и рыбок данио (John M.R. et al., 2002; Papasani M.R. et al., 2004; Dobolyi A. et al., 2003), но мало известно о функциональной роли сигнальной системы TIP39-PTH2R. Было предположено его участие в регуляции выделения гормонов из гипоталамуса и гипофиза (Papasani M.R. et al., 2004). Считается, что в почках экспрессия PTH2R ограничивается клубочковыми и другими сосудистыми клетками и не экспрессируется на канальцевых эпителиальных клетках. Физиологическая роль TIP39 и PTH2R еще не идентифицирована, но их обильная экспрессия в центральной нервной системе предполагает возможную нейроэндокринную функцию (Usdin T.B., 2000), которая, по-видимому, сохраняется в эволюции, поскольку PTH2R встречается у рыбок данио (Rubin D.A., Juppner H., 1999). Предполагается участие TIP39 в качестве нейроэндокринного фактора, который модулирует несколько аспектов реакции стресса, восприятия боли, артериального давления и температуры тела (Usdin T.B. et al., 1999a). Система TIP39-PTH2R участвует в обработке ноцицептивного сигнала и модуляции аффективного поведения (Dobolyi A. et al., 2010) но, по-видимому, не играет роли в регуляции кальция и в структурировании тканей (Hoare S.R. et al., 2000)]. Система вовлечена в регулирование почечной и сердечно-сосудистой гемодинамики у млекопитающих и осморегуляции у костистых рыб (Eichinger A., 2002; Shoemaker J.M. et al., 2005).