Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

2.1. Существующая информация о методических аспектах измерения содержания паратгормон-родственного белка в крови человека

Из-за низкой чувствительности, ранее доступные методы не могли обеспечить достоверное измерение ПТГрП у здоровых людей (Wu T.J. et al., 1997) в результате чего предполагалось, что ПТГрП отсутствует в циркулирующей крови. Измерение ПТГрП используется для диагностики и клинического ведения пациентов с подозрением на гиперкальциемию злокачественных новообразований и в настоящее время ПТГрП может быть обнаружен в крови при развитии такого состояния, (Ratcliffe W. et al., 1991; Suehiro M. et al., 1994) при вероятности смерти в 50 % через 30 дней (Stewart A.F., 2005). Таким образом, существующие диагностические исследования ПТГрП ограничены подтверждением гиперкальциемии злокачественных новообразований гуморального происхождения, но не могут обеспечить раннее обнаружение опухолей, продуцирующих ПТГрП, что требует анализов с гораздо более высокой чувствительностью.

Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), (Nordholm A. et al., 2014), иммунофлуориметрический анализ (IFMA), (Canario A.V.M. et al., 2006), и масс-спектрометрия (Kushnir M.M., 2016; Lu C.M. et al., 2002) могут использоваться для измерения ПТГрП, но имеют пределы количественного обнаружения (LOD) в пикомолярном диапазоне, которые не являются достаточно низкими для измерения уровня сывороточного ПТГрП ранней стадии рака. Кроме того, в иммунорадиометрических (IRMA) и радиоиммунологических анализах (RIA) (Ratcliffe W.A. et al., 1991; Takahashi S. et al., 2003) обычно используемых для ПТГрП, используются высокоэнергетические изотопы, такие как 125I, которые представляют опасность для здоровья и имеют короткий срок годности (Shan G. et al., 2000). Ни один из этих аналитических методов не позволяет измерять отдельные изоформы ПТГрП и, в частности, специфичную для человека изоформу ПТГрП (1–173). Эти анализы в основном нацелены на пептидный фрагмент 1–86. IRMA и RIA имеют предел количественного определения в диапазоне от 0,3 до 4 пМ, (Truong N.U. et al., 2003; Deftos L.J. et al., 2005), ELISA (Elabscience Biotechnology) – 0,5 пМ, (Nordholm A. et al., 2014), IFMA – 0,5 пМ Canario A.V.M. et al., 2006), и масс-спектрометрия – 10 пМ. (Lu C.M. et al., 2002). Кроме того, использование этих методов анализа позволяет обнаруживать только одну изоформу ПТГрП. Был разработан ряд методов RIA, в которых используются антитела против 5 эпитопов в последовательности ПТГрП (Ikeda K. et al., 1994; Pandian M.R. et al., 1992; de Miguel F. et al., 1998). ПТГрП в образцах плазмы нестабилен и подвергается быстрой деградации. Kushnir M.M et al. (2016) оценили пригодность 6 типов пробирок для забора крови. Кровь собирали в пробирки содержащие ЭДТА калия, гепарин натрия, гепарин лития, пробирки для исследования сыворотки с активатором свёртывания и для отделения сыворотки и пробирки с ингибиторами Phe-Pro-Arg-хлорметилкетона (PPACK) (Hematologic Technologies) Из оцененных типов пробирок для забора крови концентрации ПТГрП были самыми высокими в пробирках с ингибитором PPACK (анализировали сразу после размораживания). После того, как образцы хранили в холодильнике в течение 48 часов, ПТГрП разлагался до концентраций, подобных тем, которые наблюдаются в других типах пробирок для сбора биоматериала. Деградация ПТГрП начинается во время сбора крови и отделения плазмы и подразумевает необходимость забирать кровь в пробирки, содержащие ингибитор PPACK (Hutchesson A.C. et al., 1994; Kushnir M.M., 2013). Скорость деградации ПТГрП варьировала среди образцов от разных людей. Различия в снижении концентраций ПТГрП в образцах, проанализированных в свежем виде и после хранения, вероятно связаны с различиями в концентрациях эндогенных протеаз, вызывающих деградацию ПТГрП. О подобных наблюдениях сообщалось в ранних публикациях (Pandian M.R. et al., 1992; de Miguel F. et al., 1998).

Из-за неадекватной аналитической чувствительности RIA ПТГрП и плохой стабильности ПТГрП, предполагалось, что ПТГрП не присутствует в циркулирующей крови у здоровых людей (Jacobs T.P., Bilezikian J.P., 2005) и утверждалось, что измерение ПТГрП не является диагностически целесообразным, если не подозревается гиперкальциемия злокачественных новообразований. Fraser W.D. et al., (1993) оценили разработанный в лаборатории метод РИА и отметили, что у некоторых здоровых людей были измеримые концентрации ПТГрП. Контрольный уровень, определенный для здоровых людей, составлял < 2,6 пмоль/л. Концентрации ПТГрП составляли > 2,6 пмоль/л в 46 % образцов от пациентов с гиперкальциемией злокачественных новообразований. По данным Ikeda et al. (1994) концентрации ПТГрП в крови здоровых людей измеренные методом RIA составляли 0,8 пмоль/л с установленным верхним контрольным пределом 1,1 пмоль/л. При анализе большого количества образцов крови от пациентов, у которых клинически подозревалась гиперкальциемия, концентрации ПТГрП измеренные с использованием RIA были ниже предела количественного определения в 95,6 % образцов (Kushnir M.M. et al., 2016). Эти результаты предполагают, что у многих пациентов с клиническими симптомами гиперкальциемии ПТГрП не был обнаружен с помощью RIA не потому, что концентрации были слишком низкими, а из-за плохих показателей RIA. Наблюдаемый низкий показатель позитивности RIA (< 2 %) позволяет предположить, что RIA дает ложноотрицательные результаты во многих образцах. Плохое соответствие клинических данных с результатами использования метода RIA было описано в других исследованиях. Коммерческие тест-системы РИА существенно занижали концентрации циркулирующего ПТГрП, что приводит к ложноотрицательным результатам в образцах от пациентов, с подозрением на гиперкальциемию (Pandian M.R. et al., 1992; de Miguel F. et al., 1998).

Lu C.M.et al., (2002) разработали метод LC-MS/MS, который сочетает в себе разделительную способность жидкостной хроматографии с высокочувствительной и селективной возможностью масс-анализа тройной квадрупольной масс-спектрометрии. Заявленный предел количественного определения данного метода 62 нмоль/л, что недостаточно для диагностических применений.

Washam C.L. et al., (2013) разработали метод SELDI-TOF MS, представляющий комбинацию твердофазной хроматографии масс-спектрометрии для обнаружения пептида ПТГрП (12–48) в плазме пациентов с раком молочной железы.

Kushnir M.M et al. (2016) предложили метод измерения ПТГрП с помощью двумерной LC-MS/MS в режиме мониторинга множественных реакций. Нижний предел количественного определения составлял 0,6 пмоль/л, а верхний предел линейности составлял 600 пмоль/л. Общая неточность составила < 10 %. Очень плохое согласие наблюдалосьв сопоставлении с RIA. Концентрации были ниже нижнего предела количественного определения в 95,6 % образцов по данным RIA(Immunotech) и 2,0 % по данным LC-МС/МС. Среди последовательных образцов, проанализированных с помощью RIA показатель положительности составлял 1,9 %; среди последовательных образцов, проанализированных методом ЖХ-МС/МС, показатель положительности составил 26,6 %. В предложенном методе концентрацию ПТГрП определяли путем количественной оценки содержания специфического пептида, высвобождаемого во время триптического расщепления ПТГрП. Пептид 102YLTQETNK110 находится в середине последовательности ПТГрП, и хотя его концентрация не отражает концентрацию биологически активного ПТГрП, он служит маркером скорости биосинтеза ПТГрП. Пептид YLTQETNK, используемый в этом способе, является уникальным для ПТГрП, не имеет гомологии с любыми другими триптическими фрагментами человеческих белков и является специфическим суррогатным маркером для количественного определения ПТГрП.

Этот метод LC-MS/MS позволил измерить эндогенные концентрации ПТГрП у здоровых людей, и полученные данные показали, что ПТГрП присутствует в циркулирующей крови в норме. Поскольку повышенная секреция ПТГрП может быть вызвана опухолями, этот метод ПТГрП может потенциально использоваться в качестве скринингового теста для раннего выявления злокачественных новообразований, секретирующих ПТГрП, и состояний, связанных с измененной регуляцией Ca. Данные, сравнивающие уровень позитивности между этим методом LC-MS/MS и коммерческими RIA, указывают на существенную недооценку концентраций ПТГрП с помощью RIA и неадекватную диагностику ПТГрП как причины гиперкальциемии у многих пациентов. Более высокие концентрации ПТГрП наблюдались у женщин и мужчин с более низким индексом массы тела. Эти наблюдения могут объяснить более высокую распространенность остеопороза у женщин в постменопаузе с низким индексом массы тела (Kushnir M.M. et al., 2016).

Обнаружение в тканях и биожидкостях различных фрагментов ПТГрП также может предоставить уникальную возможность для оценки их наличия в качестве биомаркеров заболеваний. В недавнем исследовании была изучена информативность определения нового фрагмента ПТГрП (12–48), обнаруженного в плазме больного раком, в качестве прогностического маркера костнометастатического рака молочной железы. Используя SELDI-TOF MS, были исследованы плазменные протеомы 36 пациентов с раком молочной железы, и было установлено, что ПТГрП (12–48) может идентифицировать пациентов с риском метастазов в кости в сочетании с измерениями N-концевого телопептида (NTx) коллагена типа I в сыворотке крови (Washam C.L. et al., 2013). Поскольку генерация ПТГрП (12–48), по-видимому, специфична для опухоли, этот пептид обладает хорошими характеристиками для дальнейшего использования в качестве биомаркера, и эти исследования являются значительным прогрессом в данной области, учитывая недостаток клинически значимых биомаркеров злокачественных новообразований скелета.

Целесообразность определения содержания ПТГрП (1–86) в качестве прогностического фактора также была изучена в исследовании, в котором сравнивали 115 здоровых людей со 122 пациентами со злокачественным заболеванием. Показано, что даже при низком содержании ПТГрП (1–86) в крови пациентов его уровень можно использовать в качестве положительного показателя гуморальной гиперкальциемии злокачественных новообразований (Suehiro M. et al. 1994). Кроме того, ПТГрП (37–67) был обнаружен в экстрактах ткани поджелудочной железы, а ПТГрП (37–74) присутствует в плазме пациентов с гуморальной гиперкальциемией злокачественных новообразований (Burtis W.J. et al., 1994; Ratcliffe W.A. et al., 1994). Описан сверхчувствительный иммуноферментный метод для обнаружения ПТГрП (1–173) и его более мелких пептидных фрагментов с использованием полуавтоматического микрофлюидного устройства и меченных ферментом магнитных микросфер, снабженных множеством антител, захватывающих целевые пептиды. Пептиды измеряются одновременно путем активации ферментных меток и электрохимического обнаружения (Otieno B.A. et al., 2016). Сверхчувствительность метода достигается благодаря использованию магнитных шариков размером 1 мкм с 250 000 ± 15 000 метками HRP(Horseradish peroxidase) и 120 000 ± 8 000 антител на каждый шарик, что обеспечивает высокую эффективность захвата анализируемых молекул. Интактные изоформы ПТГрП, а также N- и C-концевые фрагменты обнаруживаются одновременно в сыворотке со сверхнизкими количественным пределом обнаружения 150 мкМ, что в 1000 раз ниже, чем в коммерческих анализах ПТГрП тест-системами IRMA и ELISA. Показана хорошая корреляция между микрофлюидным иммуноферментным методом и результатами IRMA в сыворотке крови больных раком. Статистический анализ выборки пациентов предсказывает хороший диагностический потенциал с чувствительностью 80–83 % (истинно положительный показатель) и специфичностью 96–100 % (ложно положительный показатель 0–4 %). Кроме того, этот метод обеспечивает определенную степень автоматизации, а также простоту, позволяющую проводить анализы в местах оказания медицинской помощи. Технология струйной печати обеспечивает простой и элегантный способ изготовления одноразовой недорогой сенсорной электроники для иммунорешетки. Таким образом, простота изготовления и использования коммерческих компонентов делает этот подход доступным практически для любой биомедицинской лаборатории при низких затратах. Эти преимущества делают микрофлюидные иммуноанализ перспективным инструментом для разработки чувствительных, интегрированных, портативных, клинических диагностических устройств с минимальными требованиями к образцу и реагентам.


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074