Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

3.3. Физиологические и патофизиологические эффекты пептидных доменов паратгормон-родственного белка

ПТГрП – мультипотентный белок, содержащий ряд биологически активных доменов. В физиологических условиях этот белок продуцируется во многих, если не во всех тканях организма, как в эмбриональном, так и в постнатальном периодах жизни (McCauley L.K., Martin T.J., 2012). Сообщалось о секреции ПТГрП и наличии рецепторов к нему в сердце, мозге, скелетных мышцах, мочевом пузыре, легких, желчных протоках, печени, матке, семенниках, иммунокомпетентных структурах и в большинстве эндокринных органов, включая гипофиз и С-клетки щитовидной железы (Fhilbrick W.M. et al., 1996; Urena P. et al., 1993).

Домены ПТГрП инициируют широкий спектр специфических клеточных реакций (Kronenberg H.M., 2006). ПТГрП, является критическим регулятором резорбции кости и увеличивает остеолиз при скелетных злокачественных новообразованиях. Показано, что зрелый домен ПТГрП (1–36) обрабатывается матричными металлопротеиназами (MMP) с получением стабильного продукта ПТГрП (1–17). ПТГрП (1–17) сохраняет способность сигнализировать через PTH1R для индуцирования потока кальция и фосфорилирования ERK, но не циклического производства AMP или фосфорилирования CREB. Примечательно, что ПТГрП (1–17) способствует миграции остеобластов и минерализации in vitro, а системное введение ПТГрП (1–17) увеличивает образование эктопической кости in vivo. Кроме того, в отличие от ПТГрП (1–36), ПТГрП (1–17) не влияет на формирование/функцию остеокластов in vitro или in vivo. Установлено, что ПТГрП (1–17) генерируется раковыми клетками. Таким образом, MMP-направленная обработка ПТГрП отключает остеолитические функции зрелого гормона для содействия остеогенезу, что указывает на важную роль этой схемы в ремоделировании кости в нормальных и патологических условиях (Frieling I.S. et al., 2017). Констатировано, что фрагмент ПТГрП (1–17) сохраняет способность передавать сигналы через PTH1R, благодаря чему он индуцирует остеогенную активность полноразмерного ПТГрП (1–36), но он не влияет на образование RANKL и остеокластов in vivo. Учитывая предполагаемую совместную локализацию ПТГрП с матричными металлопротеиназами при раке, предполагается, что биоактивность ПТГрП регулируется либо непосредственно MMPs, либо посредством MMP-направленной активации других протеаз в микроокружении опухоли. Более того, было показано, что сам ПТГрП индуцирует экспрессию протеаз, таких как ММР (Kawashima-Ohya Y. et al., 1998). Это, в свою очередь, может служить механизмом обратной связи для регулирования активности ПТГрП (1–36). Более полное понимание MMP-индуцированных эффектов ПТГрП может раскрыть дальнейшее понимание биологии и физиологии ПТГрП.

Низкие уровни более длинных белковых доменов ПТГрП, таких как ПТГрП (1–86), были обнаружены в крови у пациентов (Suehiro M. et al., 1994). ПТГрП (1–86), по-видимому, обладает остеотропными функциональными эффектами способствуя остеогенной дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток человека, одновременно ингибируя их адипогенную дифференцировку (Zhang K. et al., 2014). В настоящее время неизвестно, подвергается ли ПТГрП (1–86) дальнейшему протеолизу с образованием более коротких форм, чтобы опосредовать эти процессы, или же модулирует эти эффекты оставаясь нетрансформированным.

Исследование пептидов, образующихся из срединной и С-концевой области, позволит понять новые физиологические роли ПТГрП. Были описаны многочисленные пептиды ПТГрП в срединном регионе, такие как ПТГрП (38–94), ПТГрП (38–111), ПТГрП (67–86) и ПТГрП (12–48). Эти продукты были обнаружены в экстрактах клеточных культур, средах или образцах крови и тканей пациентов, проводились исследования их различных биологических эффектов (Martin T.J., 2016; Care A.D. et al., 1990; Wu T.L. et al., 1996; Strid H. et al., 2002). Показано, что ПТГрП (38–94), по-видимому, является зрелой и функционально значимой секретируемой формой (Luparello C. et al., 2001), которая может ингибировать рост и инвазию клеток, а также ограничивать жизнеспособность клеточных линий рака молочной железы, таких как MDA-MB-231. Кроме того, ослабленный онкогенез MDA-MB-231 in vivo наблюдался в ответ на воздействиие ПТГрП (38–94). В том же исследовании также был определен механизм действия ПТГрП (38–94), где было показано, что он транслоцируется в нуклеоплазму и связывается с хроматином. Это впоследствии вызывает экспрессию Bcl-xS, Bad, Rip1 и активированных каспаз-2, -5, -6, -7 и -8 (Luparello C. et al., 2008).

Детальное изучение более коротких фрагментов срединной области позволило констатировать, что ПТГрП (67–86) ограничивает рост, но усиливает инвазию клеток рака молочной железы человека 8701-BC in vitro (Luparello C. et al., 2003). Под воздействием ПТГрП (67–86) в клетках рака молочной железы усиливалась экспрессия нескольких генов, связанных со стрессом, включая белок-1, связывающий фактор теплового шока (hsbp1), и белок 90 теплового шока (hsp-90), которые изолируют и инактивируют фактор теплового шока -1 (hsf1), белок, который обычно распознает сайты связывания транскрипционных факторов ETS в промоторах генов. Это привело к повышению уровня ММР-1 и приобретению инвазивного фенотипа in vitro (Luparello C. et al., 2003). Примечательно, что это противоположный эффект, наблюдаемый у ПТГрП (38–94), который нарушает инвазию клеток рака молочной железы (Luparello C. et al., 2001). Также продемонстрировано, что ПТГрП (67–86) способствует транспорту кальция через плаценту для развития скелета плода. Это наблюдалось у мышей, гомозиготных по делеции ПТГрП, которые показывают значительное снижение градиентов ионизированного кальция у матери и плода. Однако, когда 45Ca вводили беременным мышам ПТГрП, накопление кальция в зародышах восстанавливалось при совместной инъекции ПТГрП (67–86). Интересно, что транспорт кальция не может быть обеспечен с помощью ПТГрП (1–34), что указывает на то, что эта активность уникальна для фрагмента средней области и не зависит от традиционного рецептора, PTH1R (Kovacs C.S. et al., 1996).

ПТГрП (12–48) был обнаружен при анализе протеома плазмы у больных раком молочной железы с метастазами в кости (Washam C.L. et al., 2013). ПТГрП (12–48) является первым пептидным фрагментом ПТГрП, который, как подтверждено, циркулирует in vivo, и он, скорее всего, является продуктом ферментативной обработки трех известных полноразмерных изоформ ПТГрП (Mangin M. et al., 1988). Иммуногистохимический анализ выявил локализацию ПТГрП (12–48) в опухолевых клетках костного метастаза, но этот пептид не был обнаружен в других костных стромальных клетках, таких как остеобласты или остеоциты. Кроме того,
ткани, которые обычно экспрессируют ПТГрП, такие как плацента и хрящ, также не содержали ПТГрП (12–48), что позволяет предположить, что индуцированная протеолизом генерация ПТГрП (12–48) не происходит в нормальных тканях и может быть специфичной для опухоли (Kamalakar A. et al., 2017).

Остеокласты, которые не экспрессируют PTH1R, также оказались позитивными по ПТГрП (12–48). На основании этого наблюдения способность остеокластов поглощать ПТГрП (12–48) была протестирована in vitro. Полученные данные убедительно свидетельствуют, что ПТГрП (12–48) является мощным ингибитором пролиферации и выживания остеокластов посредством мощной стимуляции клеточного апоптоза, что измеряется индукцией расщепленной каспазы 3. ПТГрП (12–48) значительно стимулировал экспрессию расщепленной каспазы 3 в остеокластах и их предшественниках. Стимуляция этого хорошо документированного показателя клеточного апоптоза была сопоставима с эффектами TNFα. Подтверждено, что ПТГрП (12–48) высвобождается в качестве паракринного ингибитора выживания кроветворных клеток. Эта активность ПТГрП (12–48) происходит перед высвобождением путем колонизации опухолевых клеток других опухолевых агентов, которые действуют эндокринным, паракринным и/или аутокринным образом (Weilbaecher K.N. et al., 2011). Опухолевые клетки высвобождают молекулы, которые активируют дифференцировку остеокластов и остеолиз, повышают активность мезенхимных клеток и других гемопоэтических клеток (включая предшественники остеокластов) локально или отдаленно (IL-8, ПТГрП, TGF-β. Та же самая опухоль также высвобождает ингибирующие молекулы ПТГрП (12–48), которые локально ингибируют выживание, дифференцировку и остеолиз клеток-предшественников моноцитов/макрофагов остеокластов, а также других гемопоэтических клеток. Локальное действие ПТГрП (12–48) реконструирует локальное микроокружение, позволяя размножаться мезенхимальным клеткам, которые, как известно, важны для ниши опухоли, в то же время модифицируя другие гематопоэтические элементы.

В отличие от ПТГрП (1–36), ПТГрП (12–48) легко интернализуется как дифференцированными остеокластами, так и предшественниками остеокластов (Kamalakar A. et al., 2017). Хотя было показано, что другие фрагменты ПТГрП транслоцируются в клетки через PTH1R, ПТГрП (12–48), по-видимому, интернализуется неканоническими механизмами. В совокупности молекулярное моделирование позволило предположить, что ПТГрП (12–48) может быть способен к слабым взаимодействиям с PTH1R. Однако биохимические, конформационные, фармакологические и биофизические данные убедительно свидетельствуют о том, что ПТГрП (12–48) не является агонистом/антагонистом PTH1R, поскольку в нем отсутствуют критические N-концевые аминокислоты (остатки 1–11), которые активируют G-белок– связанные сигнальные системы, которые увеличивают цАМФ. (Nguyen M. et al., 2001); Lam M.H. et al., 1999); Truant R., Cullen B.R., 1999; Gu Z. et al., 2012). В настоящее время не подтверждено, какие именно протеазы генерируют ПТГрП (12–48). Показано, что в C-терминальном процессинге участвует сериновая протеаза пролилолигопептидаза (Kamalakar A. et al., 2017). В других сообщениях предполагается, что дипептидилпептидаза может расщеплять ПТГрП между аминокислотами 48 и 49 (Martin T.J., 2016). N-концевой процессинг может происходить либо в локусе Lys11, либо в Asp10, при этом Lys11 затем удаляется с помощью аминопептидазы (Kamalakar A. et al., 2017).

В дополнение к сложности функции, ПТГрП (38–64) может стимулировать рост клеток легких II типа, что может иметь значение для восстановления легких. При экзогенном введении этого пептида наблюдалось увеличение количества клеток типа II, положительных по отношению к пролиферирующим клеточным ядерным антигенам (маркер пролиферации) и клеток, экспрессирующих щелочную фосфатазу (маркер клеток типа II), в дополнение к увеличению включения тимидина (Hastings R.H. et al., 2002).

Растущее количество доказательств демонстрирует, что пептиды могут генерироваться из С-концевой части ПТГрП (37–139, 37–141, 37–173) и что они потенциально обладают уникальной активностью, действуя через PTH1R, другие сигнальные рецепторы или с помощью ядерной транслокации. Наиболее изученным С-терминальным доменом ПТГрП является ПТГрП (107–139), также известный как остеостатин (Fenton A.J. et al., 1991). Хотя протеазы и процессы, участвующие в образовании ПТГрП (107–139), недостаточно хорошо охарактеризованы, остеостатин может представлять собой важную секреторную форму ПТГрП. Исследования, сфокусированные на активности этого пептида, последовательно демонстрируют его способность ингибировать активность остеокластов как in vitro, так и in vivo. Исследования с использованием культуры остеокластов крыс показали, что ПТГрП (107–139) уменьшает количество мононуклеарных предшественников остеокластов (Fenton A.J. et al., 1993). Последующие исследования с использованием in vivo модели, в которой ПТГрП (107–139) вводили через надкостницу в черепную кость показали уменьшение количества остеокластов вместе с уменьшение числа остеобластов, что указывает на то, что С-концевая область ПТГрП участвует в регуляции активности остеокластов (Cornish J. et al., 1997). Антирезорбтивная активность домена ПТГрП (107–139), по-видимому, определяется преимущественно пептидом ПТГрП (107–111), поскольку исследования, сосредоточенные исключительно на этой последовательности, указывают на профиль активности, очень похожий на ПТГрП (107–139). Установлено, что ПТГрП (107–139) оказывает влияние на кожу, сердце и костную ткань. ПТГрП (38–94), чей клеточный рецептор доставерно неизвестен, способен активировать внутриклеточные Ca 2+ -пути при низких концентрациях и участвует в транспорте кальция от матери к плоду через плаценту, которая является единственной нормальной тканью, где этот домен белка оказывает влияние (Whitfield J.F., 2007). Фрагмент ПТГрП (38–94) в значительной части исследований связывают с неопластическими процессами (Luparello C., 2010). N-концевой пептид проявляет свойства, во многом сходные с N-концевым доменом паратгормона. Аминокислотная последовательность N-концевой области (аминокислоты с 1 по 36) идентична у пяти видов млекопитающих (собака, кошка, человек, крыса и мышь), у которых существует и высокая степень гомологии срединной области ПТГрП. Высокая степень межвидовой гомологии указывает на важность N-конца и средней области в функции ПТГрП. Центральный пептидный фрагмент ПТГрП (38–94) и С-концевой пептид (107–141) обладают биологической активностью, отличающейся от эффектов домена (1–34) (Orloff J.J. et al., 1994). Срединная область белка (midregion) содержит сигнальный пептид ядерной локализации (NLS), участвует в регуляции транспорта кальция и пролиферации клеток, а С-концевой домен (102–141) модулирует активность остеокластов, влияет на их пролиферацию (Zuscik M.J. et al., 2002), оказывая угнетающее действие на резорбцию костной ткани в пробирке и в естественных условиях (Hook V.Y. et al., 2001). Фрагмент С-концевого домена ПТГрП (107–111) ингибирует костную резорбцию остеокластами (Fenton A.J. et al., 1991) и этот эффект связан с активацией протеинкиназы С. Специфический рецептор к этому пептиду постулирован, но пока не идентифицирован (Schluter K.D., 1999). N-концевой и C-концевой домены ПТГрП по разному влияют на остеогенный и адипоцитогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток человека (Casado-Diaz А. et al., 2010). C-терминальный домен ПТГрП может иметь более длительный период полувыведения из кровотока, чем N-концевой или срединный домены этого белка. Роль сигнального пептида ядерной локализации (NLS) и C-конца ПТГрП в процессе развития остается неизвестной, особенно в развитии Т-клеток. В экспериментах с использованием мышей, которые продуцируют усеченную форму ПТГрП, пропускающую NLS (87–107) и C-конец (108–139) белка, Jia K.Z. et al., (2017) показали, что усеченный ПТГрП (1–84) индуцировал формирование аномальных субпопуляций, нарушение пролиферации и увеличение апоптоза в тимусе, что указывает на то, что NLS и C-домен ПТГрП участвуют и необходимы для нормального развития Т-клеток.

ПТГрП обычно связывается с PTH1R через «модель двух сайтов», где взаимодействие между C-терминальным доменом активного ПТГрП (аминокислоты 15–34) и N-терминальным участком рецептора способствует аффинности связывания. Несмотря на различия в аминокислотных последовательностях за пределами аминокислоты 13, как ПТГ, так и ПТГрП содержат критический альфа-спиральный связывающий мотив в последовательности аминокислот 15–34 (Pioszak A.A. et al., 2009). Второе взаимодействие происходит между N-концевым доменом ПТГрП и юкстамембранной областью PTH1R. Считается, что это взаимодействие способствует индукции передачи сигналов (Gardella T.J., Juppner H., 2001). Специфичность различных областей ПТГрП по отношению к PTH1R поднимает важный вопрос о том, какие рецепторы участвуют в опосредовании активности пептидов среднего региона или C-концевого происхождения, таких как остеостатин. Эксперименты по анализу активности фрагментов ПТГрП позволили решить этот вопрос с помощью прогностического моделирования и структурных исследований, в то время как другие подходы включали использование ингибиторов протеинкиназы A (PKA) и протеинкиназы C (PKC), которые являются общими последующими эффекторами GPCR, используемыми для передачи сигналов PTH1R (Martin T.J., 2016; Abou-Samra A.B. et al., 1992; Kamalakar A. et al., 2017). Что касается остеостатина, то, по-видимому, эффекты ПТГрП (107–139) могут происходить посредством активации PKC, поскольку введение ингибиторов PKC стауроспорина или бисиндолилмалеимида I приводило к снижению функциональности, тогда как ингибиторы PKA, такие как H89, не влияли на активность ПТГрП (107–139) (Kaji H. et al., 1995; Errecart M.T. et al., 1995; Valin A. et al., 1997; Whitfield J.F. et al., 1994; Esbrit P. et al., 2000). Этот предпочтительный PKC-путь передачи сигналов GPCR согласуется с сообщениями, указывающими, что ПТГрП (107–111) и (107–139) индуцируют более устойчивый ответ Ca2+ по сравнению с ПТГрП (1–36).

Значительная часть информации о биологических эффектах ПТГрП была получена в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных с целенаправленной делецией в гене ПТГрП (нокаутные мыши) либо на трансгенных мышах с гиперэкспрессией этого белка в определенных тканях (Long F. et al., 2001). Подтверждение результатов экспериментальных исследований во многих случаях было получено в наблюдениях на людях с мутациями в гене ПТГрП или в гене рецептора PTH1R.