Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

5.2.1. Паратгормон-родственный протеин и хондрогенез

Хрящ представляет собой соединительную ткань которая служит нескольким пренатальным и послеродовым функциям. Хрящ обеспечивает структурную поддержку раннего эмбриона, формирует шаблон для развития эндохондральных костей, обеспечивает быстрый постнатальный рост скелета. Жизненный цикл хондроцитов состоит из стадий пролиферации, дифференцировки, созревания и апоптоза. Скорость каждого из этих процессов зависит от временных и пространственных сигналов внутри организма. Идентификация и характеристика этих сигналов составляет молекулярную основу структуры и функции хряща. Терминальная дифференциация хондроцитов приводит к формированию разных типов хряща: гиалиновый, эластичный и волокнистый. Дифференциация хондроцитов определяется спектром морфогенетических сигналов интегрированных в программу развития. Было показано, что ряд молекул участвует в образовании хряща. К ним относятся классы внеклеточных лигандов и их родственные рецепторы и цитоплазматические преобразователи (Hill D.J., Logan A., 1992), ядерные рецепторы (Underhill T.M., 2001), транскрипционные факторы или ДНК-связывающие белки (Mundlos S., Olsen B.R., 1997a), матричные белки (Mundlos S., Olsen B.R., 1997b), матричные модификаторы, включая матриксные металлопротеиназы (Wu W. et al., 2001), молекулы адгезии (De Lise A.M. et al., 2000) и цитоскелет (Daniels K., Solursh M., 1991). Кроме того, рост и развитие скелета особенно чувствительны к влиянию биомеханических сил (Hasler E.M. et al., 1999). Механическая нагрузка регулирует форму, регенерацию и старение скелета. Механические сигналы трансдуцируются через внеклеточные матрицы, модифицируют клеточно-матричные и клеточные клеточные взаимодействия и влияют на реакции транскрипции. Таким образом, взаимодействие между генетическими и биомеханическими детерминантами контролирует целостность хряща, продуцируемого как in vivo, так и in vitro (Reddi A.H., 2000). Хондрогенез представляет собой сложный и жестко регулируемый процесс, основные молекулярные механизмы которого еще не полностью поняты. Хондропрогениторные клетки разного эмбрионального происхождения (Quintana L. et al., 2008) начинают регулировать экспрессию трансформирующего фактора роста бета (TGF- β), фибронектина, N-CAM и N-кадгерина, который инициирует клеточную конденсацию и дифференцировку хряща (Hall B.K., Miyake T., 2000). Координация ряда сигнальных молекул является критическим для процесса хондрогенеза. Семейства TGF- β, BMP, Ihh и ПТГрП в настоящее время наиболее изучены. Семейство TGF-βявляется наиболее известным компонентом суперсемейства секретируемых белков, который содержит ингредиенты ингинов, активинов, ингибиторного вещества Mullerian, BMP, факторы дифференциации роста и глиальные нейротрофические факторы (Kingsley D.M., 1994). В основном существуют три подтипа (TGF- β1, TGF- β2 и TGF- β3) у людей и они участвуют в регуляции нескольких клеточных процессов таких как пролиферация, дифференцировка и апоптоз. BMP являются важными членами среди надсемейств секретируемых белков, известных как регуляторы на самых ранних стадиях хондрогенеза (мезенхимная конденсация, определение хондропрогениторов и дифференциация клеток). Кроме того, BMP играют роль на поздних стадиях созревания хондроцитов и их окончательной дифференцировки в гипертрофический фенотип (Keller B. et al., 2011). Во время раннего хондрогенеза клетки-предшественники конденсируются и дифференцируются в покоящиеся хондроциты, производя агрегацию протеогликанов и коллагена II, IX и XI типов. Этот фенотип стабильно сохраняется в гиалиновом хряще суставов, тогда как дальнейшая дифференциация происходит при эндохондральной оссификации в развитии и росте костей. ПТГрП является критическим аутокринным регулятором эндохондральной оссификации в пластине роста, что подтверждается серьезным нарушением структуры и функции ростовой пластины у ПТГрП-дефицитных трансгенных мышей (Kronenberg H.M., 2006). ПТГрП замедляет скорость созревания хондроцитов и поддерживает их в пролиферирующем состоянии. Роль ПТГрП в модулировании пролиферации хондроцитов пластины роста была доказана исследованиями in vitro в 1993 году. (Loveys L.S. et al., 1993). Хотя ПТГрП был идентифицирован как ключевой регулятор дифференциации хондроцитов в пластине роста, факторы, непосредственно регулирующие экспрессию ПТГрП, не полностью установлены. Клетки из эпифиза считаются физиологическим источником ПТГрП, однако относительная экспрессия ПТГрП в эпифизарных хондроцитах и хондроцитах в хрящевой ростовой пластине не определена. Pateder D.B. et al. (2000) установили, что экспрессия мРНК ПТГрП была в 10 раз выше в эпифизарных хондроцитах по сравнению с клетками из пластины роста. Экспрессия была самой высокой в наименее зрелых клетках и постепенно снижалась с началом созревания. Регуляция экспрессии ПТГрП была дополнительно исследована в эпифизарных хондроцитах. Как стимуляция TGF-бета1, так и цис-ретиноевая кислота заметно повышали уровни мРНК ПТГрП, тогда как стимуляция BMP-2 и ПТГрП уменьшала экспрессию этого транскрипта. Эффекты TGF- β1 и TGF- β3 (8–9-кратная стимуляция) были несколько больше, чем эффекты TGF- β2 (стимуляция в 4,9 раза). Эффект TGF-бета был дозозависимым. Чтобы проанализировать паракринный эффект эпифизарных хондроцитов и хондроцитов из ростовой пластины друг на друга, эти клетки были помещены в кокультуру, а мРНК из каждой популяции собирали отдельно через 24 часа. После культивирования уровни мРНК ПТГрП повышались в эпифизарных клетках, в то время как в хондроцитах растовых пластин уменьшалась экспрессия коллагена X типа и транскриптов гена Ihh (Indian Hedgehog). Результаты демонстрируют потенциально важные паракринные взаимодействия между этими клеточными популяциями, возможно, опосредованными ПТГрП и TGF-бета. ПТГрП экспрессируется в круглых пролиферативных хондроцитах эмбриональной зоны роста (хондроэпифиз) мыши уже в эмбриональном дне 12,5 (E 12,5) (Kronenberg H.M., 2003; Vortkamp A. et al., 1996). ПТГрП продуцируется в различных хрящевых структурах, таких как надхрящница, которая окружает реберный хрящ и гиалиновый хрящ суставных поверхностей, где ПТГрП предотвращает гипертрофическую дифференцировку хондроцитов и вторжение костной ткани в эти структуры, а также способствует моделированию связок и сухожилий во время их роста (Macica C. et al., 2011; Chen X. et al., 2007). Во время развития ПТГрП секретируется периартикулярными хондроцитами эпифизарной пластинки роста (Kobayashi T. et al., 2005; Kronenberg H.M., 2006). Установлено, что ПТГрП может изменять рост и дифференцировку клеток хрящевой эпифизарной пластины (Amizuka N. et al., 1996). ПТГрП секретируется хрящевой тканью суставов в ответ на нагрузки и участвует в регуляции состояния суставного хряща (Macica C. et al., 2011). После закрытия растительных пластин взрослые человеческие суставные хондроциты все еще продуцируют ПТГрП, что указывает на возможную роль этого фактора в постоянном суставном хряще. Однако регуляция экспрессии и функция ПТГрП в постоянном суставном хряще малоизучены. Функции ПТГрП в поддержании суставного хряща и моделирования связочного и сухожильного аппарата позволили предположить, что этот протеин может быть задействован в патофизиологических механизмах остеоартрита (Wysolmerski J.J., 2012). Во время эндохондральной оссификации ПТГрП продуцируется в околосуставных областях хряща плода (также именуемого пластиной роста) и в перихондрии. Пластина роста кости состоит из колонн пролиферирующих и дифференциирующихся хондроцитов, которые постепенно увеличиваются до прегипертрофированных, а затем и гипертрофированных хондроцитов. Рецептор PTH1R содержится в основном в прегипертрофических хондроцитах и значительно меньше в столбчатых пролиферирующих хондроцитах. Активация рецепторов PTH1R расположенных на пролиферирующих и прегипертрофированных клетках обеспечивает поддержание их пролиферации и замедление скорости их дифференцировки в гипертрофированные клетки. Считается, что ПТГрП принадлежит ключевая роль в контроле темпов созревания хондроцитов в хрящевой ростовой пластине посредством предотвращения преждевременной дифференциации хондроцитов в прегипертрофированные и в гипертрофированные хондроциты (Lanske B. et al., 1999), а также путем увеличения скорости пролиферации хондроцитов и подавления их терминальной дифференцировки. Основной регуляторной клеткой как в хондроэпифизе, так и в пластине роста является прегипертрофированный хондроцит и его основной продукт Ihh, который не только контролирует пролиферацию и раннюю дифференциацию круглых хондроцитов в плоскопролиферативные хондроциты и продуцирование ПТГрП, но и индукцию остеобластов в смежных структурах (Vortkamp A. et al., 1996; Niswander L., 2002; Kobasyashi T., 2005). ПТГрП служит в этой системе в качестве инструмента посредством которого Ihh регулирует поток дифференцированных хондроцитов через каскад их дифференцировки. Существенными особенностями этого регулирования развития являются то, что ПТГрП и Ihh, по-видимому, являются конститутивными секреторными мессенджерами, которые, вероятно, действуют через противоположные градиенты клеток с высоким содержанием лиганда и рецептора, находящихся на двух концах рассматриваемых структур роста. Поскольку развитие сжимает эти градиенты, регуляторные эффекты этих двух молекул становятся все более мощными. Примером могут служить индуцированная Ihh пролиферация прегипертрофированных хондроцитов в хондроэпифизах и в эмбриональном суставном хряще. В экспериментах с использованием культивируемых изолированных хондроцитов цыплят O Keefe R.J. et al. (1997) показали, что ПТГрП селективно дозозависимо ингибирует синтез коллагенового белка X типа без значительного влияния на синтез коллагенового белка II типа. Эти эффекты присутствовали во всех группах зрелых хондроцитов. Эти эксперименты продемонстрировали ПТГрП-индуцированную дифференциальную транскрипционную регуляцию коллагена II типа и X типа с селективным подавлением экспрессии коллагена X типа, в растущих хондроцитах. ПТГрП ингибирует созревание хондроцитов и стимулирует их пролиферацию. Созревающие хондроциты размножаются, а затем становятся гипертрофическими, характеризуются заметным увеличением метаболической активности и объема клеток. ПТГрП может регулировать преждевременную гипертрофию в пластине роста. Гипертрофические клетки осаждают большое количество внеклеточного матрикса, включая коллаген X типа, который является маркером этой стадии дифференцировки (Schmid T.M., Linsenmayer T.F., 1985). Гипертрофические хондроциты также начинают продуцировать щелочную фосфатазу, фермент, участвующий в минерализации клеток, на стадии их терминальной дифференцировки. В исследованиях на животных с генетически обусловленной избыточной либо сниженной экспрессией ПТГрП подтверждено, что ПТГрП, действуя через рецепторы PTH1R, координирует скорость дифференциации хондроцитов для поддержания упорядоченного роста длинных костей во время развития организма (Kronenberg H.M., 2006). Эффекты ПТГрП задерживающие дифференцировку хондроцитов опосредованы фосфорилированием фактора транскрипции SOX9, и влиянием на синтез мРНК, кодирующей фактор транскрипции Runx2 (Kronenberg H.M., 2006). У мышей с нокаутом ПТГрП отсутствие ПТГрП вызывало снижение пролиферации хондроцитов, их ускоренную гипертрофическую дифференциацию и приводило к преждевременной минерализации внеклеточного матрикса и апоптозу (Vortkamp A. et al., 1996; Amizuka N. et al., 1996). Однако целевая избыточная экспрессия ПТГрП под контролем хрящевого специфического промотора коллагена II типа приводила к противоположному эффекту хондродисплазии за счет задержки терминальной дифференциации хондроцитов, ингибирования апоптоза и нарушения эндохондральной оссификации (Weir E.C. et al., 1996). Наиболее изученная функция ПТГрП в зоне роста хондроэпифиза – это способность поддерживать прегипертрофированные хондроциты в клеточном цикле, тем самым предотвращая их гипертрофическую дифференциацию. Это предполагает, что в пластине роста ПТГрП поддерживает хондроциты в клеточном цикле в пределах своего диапазона сигнализации. Во время развития хряща ПТГрП поддерживает хондроциты в пролиферативном состоянии и ингибирует их терминальную дифференцировку в гипертрофированные хондроциты (Vortkamp A. et al., 1996; Kronenberg H.M., 2003; Kronenberg H.M., 2006). ПТГрП поддерживает пролиферацию хондроцитов и задерживает гипертрофию хондроцитов путем связывания с рецептором PTH1R (Weir E.C. et al., 1996; Schipani E. et al., 1997). Нокаут ПТГрП (Vortkamp et al., 1996; Mak et al., 2008 или его рецептора (Lanske et al., 1996; Guo et al., 2002; Kobayashi et al., 2002) приводит к ускоренной гипертрофии хондроцитов in vivo. Анализ гомозиготных ПТГрП-нокаутных мышей показал, что отсутствие ПТГрП во время эмбрионального развития вызывает хондродиплазию. При этом мыши умирают вскоре после рождения в связи с аномалиями в формирование эндохондральной кости (Karaplis A.C. et al., 1994; Amizuka N. et al., 1994). Пластины роста этих мышей характеризовались неорганизованной столбчатой архитектурой и укороченной пролиферативной/покоящейся зоной, что указывает на то, что хондроциты преждевременно выходят из пролиферативной зоны с целью гипертрофии и впоследствии становятся кальцифицированными. Противоположный эффект наблюдается при сверхэкспрессии ПТГрП. У трансгенных мышей с избыточной экспрессией ПТГрП зафиксировано отсроченное развитие кости с накоплением прегипертрофированных хондроцитов, (Amling M. et al., 1997) и ПТГрП-обработка эксплантатов мышиных конечностей блокирует терминальную дифференциацию хондроцитов ростовых пластин (Vortkamp A. et al., 1996). Хотя и ПТГрП и фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) способны снижать уровни мРНК коллагена X типа и активность щелочной фосфатазы в культивируемых хондроцитах, только ПТГрП может уменьшить эти параметры созревания в клетках в процессе дальнейшего хондрогенеза. (Iwamoto M. et al., 1995). Исследования локализации ПТГрП также указывают на его роль в сохранении фенотипа хряща во время развития. ПТГрП присутствует в высоких концентрациях в эмбриональном и послеродовом эпифизарном хряще, а экспрессия белка в пластине роста концентрируется в тонком слое хондроцитов, непосредственно прилегающих к гипертрофической зоне (Lee K. et al., 1995). Как в эпифизарной области, так и в пластине роста экспрессия ПТГрП уменьшается у взрослого животного. (Tsukazaki T. et al., 1995). Все эти данные указывают, что ПТГрП – основной фактор, который уменьшает скорость гипертрофии хондроцитов и последующее образование эндохондральной кости. Хондроциты гиалиновых хрящевых структур должны оставаться недифференцированными, чтобы должным образом поддерживать их функционирование. Утверждение того, что ПТГрП может регулировать дифференцировку гиалиновых хондроцитов подобно регуляции дифференцировки хондроцитов в пластине роста было основано на том факте, что мышь с делецией гена ПТГрП умирает при рождении из-за патологической минерализации реберного хряща (Karaplis A.C. et al., 1994; Lanske B. et al., 1996). Доказательства возможности такого эффекта получены в исследованиях очень простых структур носового хряща и реберного хряща, состоящих из трубки гиалиновых хондроцитов, окруженной ПТГрП-экспрессирующим перихондрием (Chen X. et al., 2006; Broadus A.E. et al., 2007). У мышей с нокаутом гена ПТГрП гиалиновые хондроциты носового хряща были полностью дифференцированы в прегипертрофированные и гипертрофированные хондроциты, что подтверждено гистологически, а также была зафиксирована значительная экспрессии мРНК коллагена X типа и Ihh во всем назальном хряще. Таким образом, эти простые гиалиновые хрящевые структуры, по-видимому, защищены от патологической минерализации только способностью ПТГрП ингибировать дифференцировку гиалиновых хондроцитов. ПТГрП, по-видимому, регулирует гиалиновую хондроцитарную дифференцировку в этих структурах через периферическую паракринную сигнализацию от перихондрия к содержащимся в гиалиновых хондроцитах рецепторам PTH1R. Ihh нацеливается на клетки перихондрия, но не сами хондроциты, и поэтому не имеет непосредственных эффектов в этих клетках.