Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

5.4.1.3.2. ПТГрП – сопряженные аспекты тканевой инженерии хрящевых структур с использованием мезенхимальных стволовых клеток

Изучение хондрогенеза стволовых клеток становится все более актуальным для разработки эффективных стратегий дифференциации при получении достаточного количества хондроцитов, необходимых для трансплантации. Из-за обширной дифференцировочной способности стволовых клеток их контролируемая дифференциация в функциональные хондроциты остается реальной проблемой. Разработка эффективных протоколов дифференциации, включающих возможность регулирования хондрогенеза и особенно решение проблемы гипертрофии МСК, становится особенно значимым для клинического применения тканеинженерных решений для суставного хряща, а также для скрининга препаратов для лечения гипертрофического остеоартрита. Функциональная хондрогенная дифференциация и стабильность фенотипа новообразованного хряща являются критическими факторами в клиническом применении стволовых клеток для восстановления хряща. Имеются данные о том, что ПТГрП действует также в постнатальном суставном хряще (Jiang J. et al., 2008) и поэтому может участвовать в поддержании стабильного суставного фенотипа. Таким образом, ПТГрП способен модулировать созревание и гипертрофию хондроцитов, что позволяет рассматривать этот белок как очень интересный инструмент для улучшения хондрогенеза МСК. Однако постоянное применение ПТГрП в хондрогенной среде подавляло хондрогенез вместо селективного ингибирования гипертрофических признаков (Mueller M.B. et al., 2013). Сравнительно мало известно о потенциальном эффекте прерывистого применения ПТГрП на хондрогенез in vitro и на хрящевую ткань in vivo. Несколько исследований сообщили об улучшении остеохондрального восстановления посредством активации рецепторов PTH1R (Kudo S. et al., 2011; Orth P. et al., 2013). Kafienah W. et al. (2007) исследовали возможность создания 3-мерного гиалинового хряща с использованием мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга пациентов с остеоартритом тазобедренного сустава. Клетки, полученные от пациентов, высевали на полигликолевые каркасы и дифференцировали с использованием трансформирующего фактора роста β3 в присутствии или отсутствии ПТГрП для регулирования гипертрофии. Использование количественного биохимического анализа и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволило выявить в тканеинженерном хряще, сконструированном из костномозговых мезенхимальных стволовых клеток, обширный синтез протеогликана и коллагена II типа, но только низкий уровень коллагена I типа. Содержание белка было почти идентично содержанию хряща, сконструированного из бычьих носовых хондроцитов. Анализ мРНК коллагена X типа выявил высокий его уровень в хондрогенных конструкциях по сравнению с таковой в недифференцированных костномозговых мезенхимальных стволовых клетках, что указывает на повышенный риск гипертрофии в клетках хрящевой ткани. Однако включение человеческого рекомбинантного ПТГрП в среду дифференцировки в дозе 1 мкМ или 10 мкМ в течение периода культивирования привело к значительному подавлению экспрессии мРНК коллагена X типа и значительному снижению активности щелочной фосфатазы. Было констатировано, что ПТГрП может подавлять ранние маркеры гипертрофии в культуре мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга пациентов с остеоартритом без какого-либо снижения качества инженерного хряща. Авторам удалось впервые продемонстрировать осуществимость тканевой инженерии гиалинового хряща из костномозговых мезенхимальных стволовых клеток успешно создав трехмерный хрящ высокого качества. Использование тщательно упорядоченной последовательности сигналов дифференцировки клеток показало возможность генерации гиалинового хряща и создания относительно зрелых 3-мерных имплантатов хряща с использованием аутологичных стволовых клеток для восстановления суставов у пациентов с остеоартритом. Большой проблемой при использовании МСК для реконструкции суставного хряща является создание клеток, которые устойчивы к гипертрофии и терминальной дифференцировке. Общие протоколы in vitro для хондрогенной дифференцировки МСК успешно индуцируют экспрессию молекул, присущих хрящевой ткани, включая коллаген II типа и аггрекан, и приводят к фенотипу, подобному хондроциту. Однако во время хондрогенной индукции МСК одновременно приобретают гипертрофические свойства. В процессе хондрогенеза in vitro МСК дополнительно имеет место активация экспрессии коллагена I типа и гипертрофии клеток, что подтверждается повышением содержания в них коллагена X типа, MMP13 и активности щелочной фосфатазы. Как следствие, дифференцированные МСК подвергаются минерализации и васкуляризации после эктопической трансплантации в процессе, подобном эндохондральной оссификации (Pelttari K. et al., 2008). В то время как коллаген II типа является основным структурным коллагеном в хрящевом внеклеточном матриксе, МСК, культивируемые в хондрогенных условиях, поддерживают секрецию коллагена I типа, сопровождающуюся повышением регуляции коллагена X типа параллельно с постепенным понижением уровня коллагена IIA1 типа до более поздних стадий, что указывает на то, что они не останавливают исходную программу и подвергаются гипертрофии (Hardingham T.E. et al., 2006). Изучение развития суставного хряща становится важным поскольку оно обеспечивает лучшее понимание механизмов регенерации при разработке новых терапевтических стратегий для регенерации хряща. В контексте восстановления хряща и биологии развития предложена концепция «реинжиниринга развития» для реставрации суставного хряща, предусматривающая целесообразность реконструирования стадий развития суставного хряща у взрослых поврежденных тканей (Occhetta P. et al., 2016). Молекулярные пути, взаимодействующие в процессе развития хряща, представляют собой сложные, тонко настроенные многоступенчатые процессы, которые еще не полностью выяснены. Попытка повторить эти моменты развития хрящевой ткани показала, что рекапитуляция физиологических пространственно-временных сигналов способствует образованию in vitro фенотипически стабильного человеческого суставного хряща и что зональная организация и устойчивость к гипертрофии возможны в in vitro модели хондрогенеза МСК (Ng J.J. et al., 2017). Исследуя развитие хряща, Fisher M.B. et al. (2014) получили данные, что скорость созревания, а не состояние созревания конструкции, созданной хрящевой тканью, может быть важным фактором для интеграции в хрящ.

МСК были предложены в качестве идеального источника клеток для регенерации межпозвонковых дисков, причем все большее число исследований демонстрирует способность как костномозговых МСК, так и МСК из жировой ткани дифференцироваться в NP-подобный фенотип (дискогенная дифференциация) (Clarke L.E. et al., 2014; Buckley C.T., Kelly D.J., 2012; Peroglio M. et al., 2013). Исследования in vitro и in vivo свидетельствуют о том, что мезенхимальные стволовые клетки способствуют регенерации межпозвонковых дисков путем дифференциации по отношению к фенотипу диска и синтезу матрикса и/или паракринной сигнализацией в эндогенные клетки, тем самым способствуя формированию более здорового фенотипа диска. (Peroglio M. et al., 2017). Исследования in vivo также продемонстрировали способность имплантированных МСК улучшить производство матриц, в частности синтез гликозоаминогликана, и увеличить высоту и гидратацию диска (Marfia G. et al., 2014; Omlor G.W. et al., 2014). Однако существуют доказательства того, что утечка клеток после имплантации МСК в межпозвонковые диски может привести к образованию периферических остеофитов, и это подчеркивает необходимость тщательного проектирования любой стратегии имплантации клеток (Vadala G. et al., 2012). Точно так же хондрогенная дифференциация МСК для регенерации хряща имеет потенциальный риск гипертрофии и оссификации, и еще предстоит выяснить возможную роль ПТГрП в событиях дискогенной дифференциации. В настоящее время осуществляется поиск новых возможных направлений терапевтического применения хондротропных эффектов лигандов рецептора PTH1R и в том числе фармпрепарата абалопаратида, являющегося аналогом N-концевого домена ПТГрП, который обладает хондротропными свойствами его нативного домена. Недавно было сообщено, о проведении исследования влияния абалопаратида на дегенерацию поясничных межпозвонковых дисков в рамках которого исследователи проводят рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое клиническое испытание фазы 2 эффекта абалопаратида для лечения дегенеративного заболевания поясничного диска (ClinicalTrials.gov Идентификатор: NCT03708926).

Идеальный тканеинженерный каркас для трансплантации дыхательных путей должен способствовать приживлению экзогенных клеток и росту эндогенных клеток, пролиферации и соответствующей дифференциации при сохранении полноценной воздушной трассы. Более того, этот каркас должен быть способен содействовать быстрому развитию и поддержке сосудистой сети, чтобы обеспечить выживаемость клеток и функциональную дифференциацию. На сегодняшний день в технике тканевой инженерии трахеи предложены две основные стратегии: 1 – децеллюляризированная человеческая трупная донорская ткань или 2 – синтетические каркасы, созданные de novo, которые предлагают новый путь для реконструкции дыхательных путей. Децеллюляризированные ткани были исследованы как альтернатива синтетическим каркасам для тканеинженерных конструкций в интересах регенеративной медицины (Hoshiba T. et al., 2010; Crapo P.M. et al., 2011; Song J.J., Ott H.C., 2011). В последнее время децеллюляризированные матриксные конструкции получили пристальное внимание в снижении гипертрофического потенциала во время хондрогенной индукции МСК. В процессе децеллюляризации органы или ткани подвергаются физическому или химическому воздействию для удаления клеток и иммуногенных материалов из внеклеточного матрикса, однако с сохранением его ультраструктуры и компонентов поддерживающих биомеханические свойства органа, а также биоиндуктивный профиль трансплантата (Zang M. et al., 3013; Sun F. et al., 2015). Хотя биоиндуктивные свойства микроструктур децеллюляризированных каркасов трахеи еще не полностью понятны не исключена их вовлеченность в процессы хондрогенеза и участие в процессах дифференциации хондроцитов биологически активных факторов, находящиеся во внеклеточном матриксе. Это демонстрируется не только репопуляцией хондроцитов и повторной эпителизацией, но и наличием мышечных пучков, серозных желез и нервных волокон, которые наблюдались в тканеинженерных трахеальных трансплантатах, созданных с использованием децеллюляризированных каркасов (Conconi M.T. et al., 2005; Berg M. et al., 2014). Преимущества использования естественного внеклеточного матрикса в технике создания тканеинженерного хряща включают в себя не только формирование функциональной специфической ткани, зависящей от нескольких условий, таких как цитокины внутри внеклеточного матрикса и уникальных поверхностных анатомических характеристик, (Benders K.E. et al., 2013; Tottey S. et al., 2011), но также и микроокружения стволовых клеток во время их развития in vitro (Pei M. et al., 2011; He F. et al., 2009; Choi K.H. et al., 2010). Потенциальные хондроиндуктивные эффекты факторов роста сохраняются в таком внеклеточном матриксе.

Использование МСК продемонстрировало их потенциал для тканевой инженерии. Однако успех был переменным и ограниченным при воссоздании инженерных тканей, похожих на нативный хрящ с точки зрения функции или структуры. Другой проблемой для инженерии ткани хряща с использованием МСК является регулирование их дифференцировки, поскольку клетки могут быть вовлечены в процесс хондрогенной гипертрофии с последующей минерализацией матрицы и оссификацией, Эффективное управление хондрогенезом стволовых клеток и контроль гипертрофии хондроцитов необходимы для стабильного образования хряща. В настоящее время существуют значительные проблемы в объединении установленных биохимических и биофизических факторов в хорошо и своевременно согласованном формате для контроля хондрогенеза стволовых клеток. Вышесказанное позволяет констатировать, что, для получения адекватных высококачественных хондроцитов in vitro первой задачей, которую необходимо решить является предотвращение гипертрофии МСК в процессе хондрогенной дифференциации. Понимание роли сигнальных путей и биологически активных факторов, включая ПТГрП, которые вовлечены в процесс хондрогенеза, будет полезно для контроля гипертрофии при создании тканеинженерного хряща. (Chen S. et al., 2015). Чтобы улучшить клиническую эффективность применения стволовых клеток для репарации суставного хряща, необходимо более полное понимание факторов и условий, которые влияют на хондрогенез стволовых клеток в их специфической дифференцировке и фенотипической стабильности образования хрящей после дифференциации (Toh W., 2014). Одной из потенциальных областей улучшения в этом отношении может быть разработка более полной библиотеки маркеров клеточной поверхности, обнаруженных на МСК, для улучшения выбора клеток, которые наиболее способны продуцировать функциональные ткани. Использование МСК для терапевтических стратегий требует протоколов и технологий, которые еще не прошли клинические испытания. Недавние достижения в исследовании биологии МСК позволили понять альтернативные возможности их применения. Благодаря использованию передовой технологии CRISPR/Cas9. (CRISPR – Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) существует огромный потенциал для достижения лучших клинических результатов от использования модуляции генов. (Lee W.Y.-W., Wang B., 2017; Cyranoski D., 2016; Gibson G., Yang M., 2016; Van den Akker G. et al., 2016). Лучшее понимание биологии МСК, включая роль ПТГрП в их хондрогенной дифференциации, вероятно, улучшит будущие клеточные методы терапии и стратегии тканевой инженерии хрящевой ткани (Mobasheri A. et al., 2014).

Авторы этой главы полагают возможным и необходимым констатировать, что в доступной литературе нет информации о взаимосвязи хондроиндуктивных эффектов ПТГрП и техникой тканевой инженерии трахеи включающей хондрогенную индукцию МСК. Это позволяет считать целесообразным привлечение внимания исследователей, занимающихся проблемой создания тканеинженерных конструкций трахеи для нужд регенеративной медицины, к вопросу о возможности использования ПТГрП в процессе эффективного управления хондрогенезом стволовых клеток и контроля гипертрофии хондроцитов, при формировании функциональной специфической хрящевой ткани.