Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

12.4.1. Экспериментальные данные о роли паратгормон-родственного протеина и его фрагментов в репаративном остеогенезе при нарушении анатомической целостности и морфофункциональных характеристик костных структур

В последние годы физиологические остеогенные и хондротропные эффекты ПТГрП все больше привлекают внимание исследователей и специалистов-клиницистов в области травматологии и регенеративной медицины. Результаты ряда исследований свидетельствуют, что экзогенный ПТГрП усиливает формирование костей in vivo и in vitro (Hildreth B.E. et al., 2010; Lozano D. et al., 2011). Выводы предыдущих исследований, в которых предполагалось, что ПТГрП действует как анаболический агент для остеобластов, подтверждены данными (Xue Y. et al., 2005). Было установлено, что эндогенный и экзогенный ПТГрП обладает способностью усиливать образование кости, что позволило предположить, что экзогенный ПТГрП может быть полезен для заживления переломов костей (Ren Y. et al., 2011). Показано, что дефицит эндогенного ПТГрП может привести к отсроченному заживлению перелома, и продемонстрировали важную роль, которую экзогенный ПТГрП играет в заживлении перелома. Экзогенный ПТГрП воздействует на остеобласты и остеокласты, увеличивая области каллуса, образование эндохондральной кости и ремоделирование каллуса, и формирует кость с большей механической прочностью, что предполагает потенциальное применение экзогенного ПТГрП для эффективного восстановления повреждений костей и ускорения клинического заживления переломов.

Представлены убедительные экспериментальные данные о том, что экзогенный ПТГрП способствует восстановлению переломов за счет увеличения образования костной мозоли и ускорения трансформации клеток [84], в то время как эндогенный дефицит ПТГрП может привести к остеопорозу и нарушению формирования костей (Ren Y. et al., 2011; Zhu Q. et al., 2013). Установлено, что подавление остеобластных генов и экспрессии белков, а также снижение образования эндохондральной кости, образование остеобластной кости и остеокластическая резорбция кости являются потенциальными путями, посредством которых эндогенный дефицит ПТГрП ухудшает процесс восстановления перелома кости путем уменьшения формирования хрящевой и костной мозолей (Ren Y. et al., 2011). Показано, что гаплонедостаточность эндогенного ПТГрП ухудшает заживление переломов костей (Wang Y.H. et al., 2013). В последующем исследовании (Wang Y. et al., 2017), проведенном в той же лаборатории, анализировали эффекты экзогенного ПТГрП, который вводили мышам с гаплонедостаточностью (ПТГрП +/–) и контрольным животным дикого типа (WT) (ПТГрП +/+) после моделирования закрытых переломов средней диафизарной области бедренной кости. После введения ПТГрП в течение двух недель свойства каллусной ткани тестировали различными методами. Оценивали связанные с образованием кости гены и уровни экспрессии белка, минеральную плотность костной мозоли, уровни мРНК щелочной фосфатазы, коллаген типа I, уровни белка фактора транскрипции Runx-2 и инсулиноподобного фактора роста-1, чтобы исследовать роль экзогенного ПТГрП в формировании кости in vivo. Результаты этого исследования продемонстрировали, что размер каллуса и объем кальцифицированного каллуса через 1, 2, и 4 недели после моделирования перелома кости были меньше у мышей с ПТГрП +/– по сравнению с мышами WT. Перелом бедренной кости у мышей ПТГрП +/– полностью зажил на несколько недель позже, чем у мышей WT. Использование теста для оценки биомеханических свойств кости (Duvall C.L. et al., 2007) позволило выявить, что дефицит эндогенного ПТГрП может снижать биомеханические свойства в зоне перелома бедренной кости. Это позволило предположить, что эндогенный дефицит ПТГрП может привести к задержке заживления перелома. Эндогенный дефицит ПТГрП ингибирует дифференцировку хряща, а экзогенный ПТГрП способствует формированию хрящевого каллуса и превращению его в костный каллус. Это исследование подтверждает предыдущие данные о том, что подавление остеобластных генов и экспрессии белков, а также снижение образования эндохондральной кости, образование остеобластной кости и остеокластическая резорбция кости являются потенциальными путями, через которые эндогенный дефицит ПТГрП ухудшает процесс восстановления перелома кости путем уменьшения формирования хрящевой и костной мозолей (Ren Y. et al., 2011). Процесс восстановления перелома был ускорен у мышей ПТГрП +/– и мышей WT после введения экзогенного ПТГрП. Результаты этого исследования продемонстрировали, что через одну и две недели после моделирования закрытых переломов бедренной кости уровни мРНК щелочной фосфатазы, Runx-2 и коллагена типа I и уровни белка Runx-2 и IGF-1 у мышей ПТГрП +/– снижались по сравнению с WT мыши, что указывает на то, что эндогенный ПТГрП играет важную роль в заживлении переломов костей. Эти данные соответствуют результатам исследования, в котором сообщалось, что у мышей с дефицитом ПТГрП наблюдается остеопороз из-за нарушения формирования кости (Miao D. et al., 2005; 2004). Следовательно, критическая роль эндогенного ПТГрП в формировании эндохондральной кости во время нормального развития может дублироваться в формировании эндохондральной кости, происходящем в процессе заживления перелома (Wang Y.H. et al., 2013).

Показано, что ПТГрП может индуцировать остеобластическую активность и регулировать заживление переломов на поверхности кортикальной кости (Wang M. et al., 2015). Поскольку заживление перелома, по-видимому, связано с рекрутированием предшественников остеобластов, дифференцированных из клеток надкостницы и мезенхимы костного мозга, сообщалось, что ПТГрП может участвовать в первичном образовании каллуса, предположительно взаимодействуя с IGF-1 в остеобластах и остеоцитах и регулируя дифференцировку хондроцитов в эндохондральном окостенении (Okazaki K. et al., 2003).

Предполагается, что ПТГрП волокнистого слоя надкостницы является ключевым регуляторным фактором ремоделирования кости при заживлении перелома и трещины (Wang M. et al., 2015). В надкостнице, экспрессирующей ПТГрП, содержится много мезенхимальных стволовых клеток, и они, несомненно, являются мощным источником дифференцировки костей и хрящей во время заживления перелома. В экспериментах на мышах с использованием модели трещин большеберцовой кости показано, что как экспрессия ПТГрП, так и индукция образования остеобластов в надкостнице индуцировались через 3 дня после перелома. Авторы исследовали потенциальную функциональную роль ПТГрП надкостницы при заживлении трещин, используя мышей с условным нокаутом ПТГрП, у которых в надкостнице отсутствует ПТГрП, и обнаружили, что размер и форма каллуса, а также минерализация костной ткани у ПТГрП-нокаутных мышей были нарушены по сравнению с мышами, надкостница которых продуцировала этот протеин. Выявлено также нарушение образование остеобластов и активности остеокластов у мышей с нокаутом продукции ПТГрП в камбиальном слое надкостницы. Авторы заключили, что удаление ПТГрП из надкостницы ухудшает образование хрящевого каллуса, созревание и оссификацию, а также ремоделирование во время заживления трещин. Эти данные свидетельствуют о том, что ПТГрП надкостницы может индуцировать остеобластную активность и регулировать заживление перелома и трещин на поверхности кортикальной кости.

Формирование кости и ангиогенез – критически взаимосвязанные процессы. Ключевым фактором успешного приживления трансплантата является его быстрая васкуляризация. В этой связи взаимодействие ПТГрП с системой VEGF имеет первостепенное значение (Alonso V. et al., 2008). Проостеогенные и проангиогенные факторы остеобластов и сосудистых эндотелиальных клеток под влиянием ПТГрП индуцируют остеогенез и остеоинтеграцию трансплантантов, способствуя повышению их приживления (Hildreth B.E. et al., 2015). Для доставки таких факторов в локус костных дефектов используется ряд подходов. Использование локальной доставки С-концевого (107–111) и N-концевого (1–37) и доменов ПТГрП, нанесенных на имплант на основе гидроксиапатита, позволило зафиксировать формирование вокруг остеоинтегрированных имплантатов вновь образованной костной ткани. Полученные результаты продемонстрировали, что локальная доставка ПТГрП (107–111) или ПТГрП (1–37) из биодеградирующегося имплантата является перспективной тактикой улучшения репаративного остеогенеза (Ardura J.A. et al., 2016).

Следуя принципам инженерии костной ткани, биоактивность каркаса имплантов можно улучшить, загрузив его остеогенными агентами, такими как ПТГрП, который становится перспективным промотором регенерации кости. В этой связи большой интерес исследователей был проявлен к высококонсервативному фрагменту С-концевого домена ПТГрП с последовательностью 107–111, известного как остеостатин (Lozano D. et al., 2010). Показано, что N-концевые аналоги ПТГрП вызывают анаболический эффект у грызунов и людей при системном прерывистом введении (Datta N.S., Abou-Samra A.B., 2009; Esbrit P., Alcaraz M.J., 2013). Остеостатин обладает антирезорбтивной активностью (Fenton A.J. et al., 1991), а также остеогенными свойствами in vitro и in vivo (Cornish J. et al., 1999; 1997; Lozano D. et al., 2009; Rihani-Basharat S., Lewinson D., 1997). Кроме того, было показано, что нанесение остеостатина на различные типы керамических имплантатов ускоряет заживление критических и некритических дефектов кости в длинных костях взрослых нормальных и остеопорозных кроликов и крыс (De Gortazar A.R. et al., 2006; Lozano D. et al., 2012; 2014; Trejo C.G. et al., 2010). Таким образом, существующие данные указывают на то, что остеостатин является привлекательным пептидом для применения в инженерии костной ткани. При имплантации каркаса из коллаген-гидроксиапатита с иммобилизованным остеостатином в костный дефект зафиксировано существенно большее образование новой костной ткани по сравнению с каркасами без остеостатина (Quinlan E. et al., 2015). Применение имплантов на основе диоксида кремния, которые были покрыты остеостатином, существенно лучше индуцировало локальное новообразование костной ткани в сравнении с имплантами без пептидной нагрузки (Trejo C.G. et al., 2010). Нанесение остеостатина на титановые импланты для коррекции костных дефектов у крыс улучшило регенерацию костной ткани по сравнению с такими же имплантами без покрытия остеоиндуктивным эпитопом ПТГрП (Van der Stok J. et al., 2015). Эти данные демонстрируют, что доставка остеоиндуктивного фактора в конкретный локус кости может существенно модулировать процессы регенерации костной ткани.

В последнее десятилетие мезопористые биоактивные стекла были предложены в качестве оптимальных каркасов для имплантов в костный дефект. Эти стекла обладают регенеративными остеотропными свойствами и высокоупорядоченными мезопористыми структурами, позволяющими связывать и высвобождать агенты, способствующие образованию костной ткани (Salinas A.J. et al., 2013; Yan X. et al., 2004). Исследованы характеристики гибридных биоактивных стекловолокнистых каркасов, содержащих пептидный фрагмент ПТГрП остеостатин, в качестве имплантатов для применения в тканях (Coletta D.J. et al., 2014). Эксперименты с культивированием клеток in vitro проводили с использованием мышиной остеобластной клеточной линии MC3T3-E1. Воздействие остеостатин-содержащих каркасов увеличивало пролиферацию клеток в отличие от не содержащих пентапептид каркасов. В исследовании in vivo имплантировали каркасы, покрытые остеостатином, или без такого покрытия в некритический дефект бедренной кости кролика. Зафиксировано компактное формирование кости на поверхности имплантата, с ламелями, расположенными вокруг канала Хаверса, образующего остеоподобную структуру у всех подопытных животных. Имели место признаки воспаления вокруг имплантированных каркасов без покрытия пентпептидом. Это раннее воспаление не происходило в группе животных с имплантами, покрытыми остеостатином, свидетельствуя о том, что остеостатин может действовать как противовоспалительный фактор. У животных этой группы отмечено повышенное образование костной ткани, что подтверждено наличием многих новых трабекул, частично минерализованных в области регенерации имплантатов, выявленным в течение 1 месяца и более очевидным через 3 месяца после имплантации. Результаты исследований in vitro и in vivo показали, что покрытие остеостатином гибридных биоактивных стекловолокнистых каркасов улучшает их остеогенные свойства.

Эффекты каркасов из мезопористого биоактивного стекла в биологической среде могут быть улучшены путем включения ионов биоактивного металла в структуру стекла. Это относится к ионам Zn2+, которые проявляют остеогенные и ангиогенные свойства, а также антиоксидантную, противораковую и антимикробную активность (Lansdown A.B. et al., 2007; Hoppe A. et al., 2011; Zheng K. et al., 2016; Laurenti M., Cauda V., 2017). В связи с этим сочетание регенеративных свойств каркасов из мезопористого биоактивного стекла с благоприятным воздействием ионов Zn2+ вызвало интерес к потенциальной возможности их применения в биоинженерии (Sanchez-Salcedo S. et al., 2014). Исследование биологических эффектов одновременного включения ZnO и остеостатина в каркасы из биоактивного стекла позволило оценить предполагаемое преимущество включения остеостатина в каркасы, содержащие ZnO, для получения оптимального биоматериала для регенерации кости. Показано, что остеостатин улучшал цитосовместимость Zn-содержащих каркасов, усиливая пролиферацию и дифференцировку остеобластов, не влияя на их способность к образованию нанокристаллов гидроксикарбонат-апатита, аналогичных нанокристаллам в кости (Perez R. et al., 2018). Оценка способности каркасов, содержащих Zn2+ и остеостатин, с использованием пре-остеобластической клеточной культуры MC3T3-E1 влиять на дифференцировку остеобластных клеток выявила увеличение экспрессии маркера ранней дифференцировки остеобластов Runx2 в присутствии остеостатина. Показано, что каркасы, содержащие ZnO и остеостатин, увеличивают количество остеобластных клеток, а также способность дифференцировки остеобластов. Повышение остеогенной способности материалов, обогащенных остеостатином и Zn2+, указывает на потенциал применения этого подхода для инженерии костной ткани (Heras C. et al., 2019). Показано, что остеостатин повысил биологическую остеогенную эффективность каркаса из кремний-гидроксиапатита, покрытого фактором роста фибробластов (FGF2). По мнению авторов, эти данные представляют потенциальный интерес для инженерии костной ткани (Lozano D. et al., 2012) и могут рассматриваться как свидетельство целесообразности применения покрытия остеостатином биоразлагаемых каркасов для повышения их остеогенных свойств.

Ning Z. et al. (2019) показали эффективность использования гидрогеля метакрилированного желатина (GelMA) в качестве системы доставки лекарственного средства для пролонгированного высвобождения абалопаратида (более 10 дней). Инъецируемый гидрогель GelMA, содержащий абалопаратид, использовался в для ускорения заживления дефектов костей у крыс. Авторы констатировали, что гидрогель GelMA, содержащий абалопаратид, эффективен для стимуляции регенерации кости. Проведено прямое сравнение эффектов абалопаратида и терипаратида на заживление переломов на мышиной модели (Bernhardsson M., Aspenberg P., 2018). Результаты исследований свидетельствуют, что оба препарата улучшают заживление переломов на этих мышиных моделях. Абалопаратид стимулировал заживление костей как в диафизарной, так и в метафизарной моделях. Эффективность абалопаратида в расчете на микрограмм препарата в 2,5 раза выше, чем у терипаратида. Lanske B. et al. (2019) в экспериментах на 12-недельных самцах крыс моделировали односторонние внутренне стабилизированные закрытые срединно-диафизарные переломы бедра. Начиная с следующего дня животные получали ежедневные подкожные инъекции абалопаратида в дозе 5 или 20 мкг/кг/сут либо физиологического раствора (контроль) в течение 4 или 6 недель. По данным микрокомпьютернрй томографии каллусы обеих групп животных, получавших абалопаратид, имели больший объем кости, объемную долю кости, минеральное содержание кости, минеральную плотность кости и площадь поперечного сечения в обеих временных точках по сравнению с контрольной группой. Испытания на разрушающий изгиб показали большую нагрузку и жесткость костной мозоли в обеих группах в оба момента времени по сравнению с контрольными животными. Эти результаты предоставляют предварительные доклинические данные, свидетельствующие о возможности улучшения заживления переломов с помощью системно вводимого абалопаратида (Lanske B. et al., 2019).

В заключение анализа данных литературы о возможностях использования остеотропных эффектов ПТГрП и других лигандов рецептора PTH1R в клинической медицине представляется целесообразным констатировать, что ПТГрП является не только одним из важнейших регуляторов структурных и функциональных процессов в костной ткани человека, включая формирование скелета и костное ремоделирование в постнатальном периоде, но и чрезвычайно значимым фактором развития репаративного остеогенеза при различных патологических состояниях скелетных структур (Бизенкова М.Н., Курзанов А.Н., 2017). Исследования в области экспериментальной и клинической остеологии убедительно обозначили перспективы использования новых фармпрепаратов на основе аналогов его биологически активных доменов в регенеративной медицине при нарушениях анатомической целостности и морфофункциональных характеристик костных структур. Лучшее понимание того, как лекарственные средства, которые модулируют сигнальные пути, участвующие в скелетогенезе, проявляют свою эффективность, и влияют на молекулярные механизмы, приводящие к образованию костной ткани, может открыть пути к новым фармакологическим стратегиям восстановления кости. Разработка терапевтических средств, нацеленных на анаболические пути, участвующие в остеоогенезе, имеет большое значение в лечении морфологических либо метаболических нарушений костных структур или в случаях нарушения процессов восстановления кости (Roberts S.J., Ke H.Z., 2018). Полагают, что разработка и изучение других аналогов доменов ПТГрП может открыть перспективы создания новых эффективных остеанаболических терапевтических средств, которые найдут применение в решении проблем оптимизации репаративного остеогенеза. (Augustine M., Horwitz M.J., 2013; Martin T.J., 2016; Курзанов А.Н. и соавт., 2019). Предполагается, что прогресс в технологиях, которые обеспечат эффективное использование механизмов и факторов, важных для формирования скелетной ткани de novo, откроет перспективы разработки новых терапевтических тактик оптимизации процессов естественного восстановления костных структур организма.