Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Глава 7. ВЫДЕЛЕНИЕ ГАММА-ГЛОБУЛИНА
Широкое практическое применение в настоящее время имеет метод очистки, сводящийся к выделению гамма-глобулиновой фракции иммунных сывороток. Наиболее детально этот метод изучен применительно к получению так называемого «коревого» гамма-глобулина из человеческой крови:
В последние годы интенсивно изучаются методы выделения гамма-глобулина из гипериммунных сывороток против клещевого энцефалита, бешенства, лептоспироза, сибирской язвы. Обнадеживающие результаты получены при выделении гамма-глобулина из некоторых антитоксических сывороток.
Принцип метода сводится к фракционированию сывороток спиртоводными осадителями при разных значениях рН и при температуре ниже нуля. Целью фракционирования является отделение иммунного гамма-глобулина от альбумина, альфа- и бета-глобулинов. Очистка проходит в три стадии.
1 стадия. Условия: концентрация спирта 25 %, Т °С 5 °С, рН 6,8-7,2
В осадок выпадает гамма-глобулиновая фракция; кроме того, он содержит значительные примеси, главным образом, бета-глобулина. Раствор, содержащий альбумины, а также часть альфа- и бета-глобулинов после отделения осадка путем фильтрации или центрифугирования выбрасывают. Осадок растворяют в солевом растворе
(0,01 М - NаС1), после чего осуществляется вторая стадия очистки.
2 стадия. Условия: концентрация спирта 13-17 %, Т °С -3...-6 °С, рН 5,1.
В осадок выпадает бета-глобулин, липоидные вещества и небольшое количество альфа- и гамма-глобулинов. После отделения осадка раствор, содержащий очищенный гамма-глобулин, подвергается дальнейшей обработке.
3 стадия. Условия: концентрация спирта 25-26 %, Т °С 5...6,5 °С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл.
В осадок выпадает гамма-глобулин.
Для лучшей очистки гамма-глобулина допускается переосаждение белковых осадков, полученных на 1-й и 3-й стадиях очистки. Повторным извлечением гамма-глобулина из балластных белков после 2-го осаждения достигается повышение выхода.
Конечный выход гамма-глобулина составляет 8-10 % от общего белка сыворотки. Для удаления спирта и получения в сухом виде осадок подвергается сублимационному высушиванию.
Сухой гамма-глобулин до растворения может сохраняться в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием или иным поглотителем влаги не долее одного месяца.
Дальнейшей обработке может подвергаться и сырой осадок, максимально освобожденный от спирта путем суперцентрифугирования и отстаивания в течение 12-18 часов при температуре -5 °С.
При изготовлении жидкого гамма-глобулина осадок растворяется в физиологическом растворе или дистиллированной воде (если растворяется сухой осадок, в котором содержится NаС1) так, чтобы довести количество белка до 10-10,5 %. Содержание NаС1 в растворе должно быть доведено до 0,85 %. В качестве консерванта к препарату добавляется мертиолят в конечной концентрации 1:15000.
В 10 %-м растворе гамма-глобулина устанавливается рН 7,0-7,5 и с помощью рефрактометра точно проверяется количество белка. После этого раствор подвергается стерилизующей фильтрации при температуре 2-8 °С.
Разливка в ампулы производится после проверки-стерильности. Готовый препарат должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим и содержать 10 % белка. Каждая серия контролируется методом электрофореза. Выпуск препарата допускается в том случае, если гамма-глобулиновая фракция составляет 97 % от количества общего белка.
Содержание спирта в готовом препарате в тех случаях, если обработке подвергался сырой осадок, не должно превышать 4,5 %. Каждая серия профильтрованного гамма-глобулина подвергается контролю на стерильность и безвредность. Отличие от контроля безвредности сывороток заключается в количестве вводимого препарата (свинке вводится 1 доза гамма-глобулина) и длительности срока наблюдения (за мышами наблюдают 4 дня). Годным признается препарат, не вызывающий общих и местных реакций в течение периода наблюдения.
Препараты гамма-глобулина должны сохраняться при температуре 4-10 °С. Срок годности их полтора года; по истечении этого срока, если препарат не изменил своих физических свойств, он может применяться в течение еще одного месяца.
Применение сывороточных препаратов
Сыворотки и гамма-глобулины применяются с профилактическими и лечебными целями. И в том и в другом случаях важно, чтобы антитела быстро проникали в кровь. В связи с этим препараты эти вводят внутримышечно, откуда они быстро всасываются. Применяемое раньше внутривенное введение теперь не практикуется из-за возможных при этом способе введения шоковых реакций. Известно, что сывороточные препараты, содержащие чужеродный для человеческого организма белок, вызывают сенсибилизацию его; при повторных введениях препарата, аналогичного происхождения это приводит к развитию нежелательных реакций повышенной чувствительности.
Очищенные от балластных белков сыворотки в значительной степени, но не совсем, освобождаются от сенсибилизирующих свойств. В связи с этим как нативные, так и очищенные сывороточные препараты должны вводиться с соблюдением определенных правил предосторожности. В настоящее время все иммунные сыворотки снабжаются разведенной (1:100) очищенной лошадиной сывороткой, разлитой в отдельные ампулы по 1 мл. Эта сыворотка предназначена только для выявления состояния повышенной чувствительности у детей и взрослых к белку лошадиной сыворотки. Для лечения и профилактики инфекционных болезней она не применяется.
Разведенную сыворотку употребляют непосредственно перед введением лечебной или профилактической дозы всех видов антитоксических сывороток с целью предупреждения анафилактических реакций. Сыворотка вводится внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья в объеме 0,1 мл. Наблюдение за реакцией ведется в течение 20 минут.
Если диаметр папулы за это время не превышает 0,9 см и вокруг нее отмечается ограниченная гиперемия, реакция считается отрицательной. В таком случае иммунную сыворотку вводят подкожно, сначала в количестве 0,1 мл, если реакция отсутствует - через 30 мин - 1 час всю остальную.
При положительной реакции на разведенную сыворотку, введенную внутрикожно, папула увеличивается в диаметре до 1-3 и более сантиметров и окружена большой зоной гиперемии. В этом случае, если имеются безусловные показания к введению сыворотки, это делают с особыми предосторожностями. Сначала вводят под кожу разведенную сыворотку в дозах 0,5-2,0-5,0 мл с интервалами 15-20 минут. Если реакция отсутствует, то вводят неразведенную сыворотку, сначала 0,1 мл, а затем через 30 минут, при отсутствии реакции, - всю остальную.
Если в ответ на введение малых доз возникает реакция, рекомендуется вводить сыворотку под наркозом (гексоналовым, пентоталовым и др.).
Усложнение приемов серотерапии и профилактики оправдывается стремлением предохранить организм от осложнений, связанных с повышенной чувствительностью к чужеродному белку в тех случаях, когда это не может послужить поводом к отмене введения сыворотки (дифтерия, столбняк, ботулизм, клещевой энцефалит и др.).
При появлении анафилактических реакций больному вводят адреналин, эфедрин, новокаин, хлористый кальций, глюкозу, гормональные препараты и сердечные средства в дозах, указанных в специальных наставлениях, которыми снабжается каждая коробка с сывороточными препаратами.
В этом разделе необходимо остановиться на перспективах использования гамма-глобулина, выделенного из человеческой крови. До недавних пор он, применялся, гласным образом, для профилактики кори. Однако его применение для предупреждения других болезней, показало несомненную ценность. Это обусловлено содержанием в нем антител против соответствующих возбудителей (коклюша, оспы, по-видимому, эпидемического гепатита). Выпускается же гамма-глобулин без указания титра, антител, за исключением титра гриппозных антител в гамма-глобулине, полученном из крови иммунизированных гриппозной вакциной доноров. По-видимому, в ближайшее время будут указываться титры и других антител. Возможно, что расширится приготовление гамма-глобулинов из крови иммунизированных разными антигенами доноров. Таким образом человеческий гамма-глобулин перестанет быть только «коревым» и распространит свое влияние на другие области инфекционной патологии.