Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Глава 9. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДИАГНОСТИКУМЫ И АНТИГЕНЫ
Диагностические препараты применяются для следующих целей:
1) для определения с помощью специфических иммунных сывороток вида или типа микроба выделенного от больного, носителя или из объектов внешней среды;
2) для обнаружения с помощью диагностикумов антител в сыворотке больных или реконвалесцентов;
3) для выявления с помощью аллергенов перестройки организма, возникающей при некоторых инфекционных заболеваниях.
Все диагностические препараты представляют собой антигены или антитела.
Общие сведения о диагностикумах
Диагностикумы - это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в качестве антигенов для серологических реакций.
Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов и др.).
Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя.
Более тонкие различия антител в изучаемой сыворотке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий паратифа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшнотифозными бактериями; Н-диагностикум представляет собой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвижностью.
Бактерийные диагностикумы
Для приготовления бактерийных диагностикумов берется агаровая суточная культура определенного вида микроба, находящегося в S-форме.
Культуры должны агглютинироваться соответствующими эталонными сыворотками в разведении до титра, определяемого реакцией агглютинации на три креста, а также быть типичными по морфологическим и биохимическим свойствам. Агглютинация с гетерологичными сыворотками в разведении выше 1/8 титра не должна иметь места.
Производство диагностикумов, как и всех биологических препаратов, требует стерильных условий.
Проверенные 18-20 часовые агаровые культуры или 4 часовые бульонные засевают на матрацы с агаром, приготовленным на мясном, дрожжевом или казеиновом гидролизате. Через 18-20 часов инкубации в термостате при 37 °С из культур делают мазки (с каждого матраца отдельно) для проверки чистоты. Затем культуру смывают физиологическим раствором и полученную взвесь разных штаммов одного вида микробов сливают в одну градуированную бутыль. При массовом производстве применяется котловой метод выращивания бактерий. Диагностикумы готовят из разных количеств штаммов соответствующих микробов.
Густоту маточной взвеси определяют по оптическому стандарту. Допускается получение маточной взвеси, содержащей в 1 мл 10 млрд. микробных тел. Далее маточная взвесь инактивируется. Инактивацию можно проводить различными способами: прогреванием, действием формалина, алкоголя и др. Так, для определения фагоцитарной активности лейкоцитов диагностикумы готовят из микробов, убитых нагреванием, так как фенол или формалин обусловливают отрицательный хемотаксис лейкоцитов.
При изготовлении формалинизированных диагностикумов к 10-миллиардной взвеси добавляют разные количества формалина в зависимости от вида диагностикума. После прибавления формалина бутыль закрывают резиновой пробкой, тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 18-20 часов или оставляют на 2 суток при комнатной температуре. По истечении этого срока производят посев для определения стерильности, после чего проверяют агглютинабильность маточной взвеси с гомологичными сыворотками. Маточную взвесь разводят формализированным 0,1 % физиологическим раствором до густоты в 3 млрд. по оптическому стандарту. После разведения диагностикума снова производят контроль на стерильность.
Для изготовления спиртового диагностикума суточная культура О-штамма смывается с матрацев физиологическим раствором, содержащим 0,5 % карболовой кислоты. Маточная взвесь разводится до густоты 4-х млрд. в 1 мл. Для разведения применяется смесь карболизированного физиологического раствора с 96 % этиловым спиртом, взятым в соотношении 1:2. Спирт предварительно фильтруется через бактериальный фильтр. Содержимое бутылей тщательно перемешивается. Диагностикум помещается на 48 часов в термостат при 37 °С и затем оставляется на трое суток при комнатной температуре. Спиртовые диагностикумы также контролируются на стерильность.
Готовый диагностикум проверяют на агглютинабильность гомологичной агглютинирующей сывороткой и для выявления групповых агглютининов - гетерологичными сыворотками. Кроме того, диагностикум испытывают в реакции агглютинации с сыворотками здоровых людей (5 сывороток). Реакцию агглютинации с диагностикумами ставят по классической методике.
Готовые диагностикумы разливают в ампулы по 5 или 10 мл; они, как правило, содержат 3 млрд. микробных тел в 1 мл за исключением туляремийного, содержащего 50 млрд. бактерий в 1 мл, и бруцеллезного диагностикума, содержащего 20 млрд. микробных тел в 1 мл. После контроля производят этикетировку препарата. Диагностикумы годны в течение года с момента разведения маточной взвеси.
Формалинизированные Н-диагностикумы дают крупнохлопчатую Н-агглютинацию, при которой хлопья легко разбиваются, в связи с чем при чтении реакции следует избегать сильного встряхивания пробирок. О-диагностикумы дают мелкозернистую агглютинацию, не разбивающуюся при встряхивании.
Используется также Vi-диагностикум, позволяющий обнаружить Vi-антитела в сыворотках больных брюшным тифом и бактерионосителей.
Он представляет собой взвесь брюшнотифозных палочек, обезвреженных формалином (0,4 %). Для получения препарата рекомендуются штаммы в V-форме, типичные по всем признакам и не имеющие жгутикового аппарата. Диагностикум содержит 3 млрд. микробных тел в 1 мл взвеси. Специфическая активность его проверяется в реакции агглютинации с эталонной монорецепторной Vi-сывороткой. Срок годности 1 год.
В ряде случаев для целей серологической диагностики применяют не корпускулярные диагностикумы, а выделенные из микробных тел антигены.
Микробная клетка представляет собой сложный глюцидо-липоидно-полипептидный комплекс, в который входят как полноценные антигены, так и гаптены. Изготовление полных антигенов проводится по способу Буавена и Мезробеану. Для этой цели берут хорошо изученную чистую культуру определенного вида микробов и производят посев на питательные среды. Через сутки инкубации при 37 °С смыв культуры дважды промывают (при центрифугировании), физиологическим раствором, затем экстрагируют при низкой температуре десятикратным количеством 1/4 N раствора трихлоруксусной кислоты. Экстракт нейтрализуют углекислой содой до рН 7,0 и диализуют в течение 2 суток в текучей водопроводной воде и в течение 1 суток - в дистиллированной воде. Диализованный экстракт осаждают четырьмя объемами ацетона, растворяют в дистиллированной воде и вторично осаждают ацетоном. Полученный осадок полного антигена промывают спиртом и эфиром, высушивают и хранят в виде сухого порошка.
Антигены из микробных клеток извлекают и другими способами: многократным замораживанием с последующим оттаиванием, кипячением, действием ультразвука, спирта, соляной кислоты и др.
Бактерийные антигены применяются в реакциях преципитации, пассивной гемагглютинации с диагностическими целями и для изучения антигенного аппарата микробов и их типизации.
В настоящее время разработаны методы приготовления эритроцитарных диагностикумов с длительным сроком годности. Действующим началом их являются извлеченные из тех или иных микроорганизмов антигены, которыми сенсибилизированы эритроциты.
Принцип приготовления эритроцитарных диагностикумов сводится к следующему: дефибринированная кровь человека О (1) группы или барана фильтруется через марлю и трижды отмывается на центрифуге охлажденным физиологическим раствором. После этого производится обработка эритроцитов формалином. Готовят взвесь, содержащую 12,5 % эритроцитов, в нее помещают целофановый мешок с формалином и встряхивают на шюттель-аппарате в течение 16 часов. В первые 2 часа формалин поступает через поры целофана, затем его прокалывают и, наконец, разрывают. Этот прием позволяет получить медленное вначале и постепенно усиливающееся действие формалина на эритроциты. По окончании срока встряхивания эритроциты вновь фильтруют через марлю, отмывают 6 раз десятикратным объемом охлажденного до 4-5 °С физиологического раствора на центрифуге при 2500-3000 об/мин, соединяют с равным объемом стерильного нейтрального физиологического раствора и разливают во флаконы. В таком виде формалинизированные эритроциты можно хранить до года. В дальнейшем, в зависимости от характера антигена, эти эритроциты либо обрабатывают дополнительно таннином, либо соединяют с антигеном без этой обработки.
Так, для приготовления дифтерийного и столбнячного эритроцитарных диагностикумов, формалинизированные эритроциты отмывают один раз физиологическим раствором (рН 7,2), разводят их до 2,5 % концентрации, добавляют равный объем таннина в разведении 1:20000, взбалтывают и выдерживают 15 минут при комнатной температуре. Затем эритроциты отмывают 3 раза пятью-шестью объемами физиологического раствора (рН 7,2). Проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации, готовят 2,5 % взвесь, к которой прибавляют очищенные, концентрированные анатоксины - дифтерийный (10-20 Lf на один миллилитр взвеси) или столбнячный (5-10 ЕС на один миллилитр взвеси).
Смесь выдерживают при 37 °С - 3 часа. За один час до окончания инкубации добавляют 1 % формалина, встряхивают жидкость до образования равномерной взвеси. После этого срока эритроциты снова отмывают три раза нейтральным физиологическим раствором, содержащим 1 % формалина. Отмытые сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,0) с формалином (1 %) так, чтобы в 0,05 мл взвеси содержалось 6-8 млн. эритроцитов (подсчет в камере Горяева). В препарате проверяют густоту взвеси, отсутствие спонтанной агглютинации, специфическую активность с соответствующими иммунными сыворотками. Для контроля применяют эритроциты, обработанные таким же способом только не сенсибилизированные антигеном.
Срок годности столбнячного и дифтерийного эритроцитарных диагностикумов - 6 месяцев.
При изготовлении туляремийного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном, полученным по методу Буавена и Мезробеану из высушенных туляремийных бактерий.
Для постановки реакции употребляют 2,5 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Активность препарата проверяют в реакции непрямой гемагтлютинация с агглютинирующей противотуляремийной сывороткой. Если сенсибилизированные эритроциты агглютинируются этой сывороткой в разведении ее меньшем, чем предусмотрено инструкцией - эритроцитарный диагностикум бракуется.
Срок годности препарата - 9 месяцев.
Эритроцитарный Ви-диагностикум представляет собой формалинизированные эритроциты человека 0 (1) группы, сенсибилизированные очищенным Ви-антигеном брюшнотифозных бактерий, в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Препарат стандартизируют таким образом, чтобы 1 мл взвеси содержал 50 млн. эритроцитов. Специфическая активность эритроцитарного Ви-диагностикума определяется в РНГА с одной адсорбированной брюшнотифозной Ви-сывороткой и пятью сыворотками людей, привитых против брюшного гифа. Препарат годен в течение шести месяцев.
Риккетсиозные диагностикумы
Для дифференциальной диагностики риккетсиозов серологическим методом в постановке реакций связывания комплемента и агглютинации широко применяются цельные риккетсиозные антигены. Для приготовления диагностикумов из риккетсий могут быть использованы куриные эмбрионы, белые мыши, платяные вши.
Для заражения куриных эмбрионов используются штаммы риккетсий Провачека, Музера и Бернета.
Риккетсии культивируют в желточном мешке эмбриона. После размножения риккетсий желточные мешки, извлеченные стерильными пинцетами из вскрытых яиц, помещают в стерильные банки со стеклянными бусами (5-10 желточных мешков в банку) и измельчают путем тщательного встряхивания. К полученной массе добавляется физиологический раствор из расчета 10 мл на 1 желточный мешок. Все вновь тщательно встряхивается для лучшего измельчения тканей, и затем, в каждую банку добавляется еще 100 мл физиологического раствора, содержащего формалин в количестве от 0,8 (для культур риккетсий Провачека и Музера) до 1 % (для риккетсий Бернета) и 10 % фосфатного буфера с рН 7,0. После встряхивания банки помещаются в рефрижератор и хранятся там до истечения срока обезвреживания.
В дальнейшем полученная указанным способом первичная взвесь риккетсиозного материала сводится в бутыли соответствующей емкости (по 100 желточных мешков).
Дальнейшая обработка первичной взвеси риккетсий Провачека и Музера производится не ранее 48 часов пребывания риккетсиозного материала в формалинизированном физиологическом растворе, а риккетсий Бернета только после 15 дней пребывания в этих же условиях.
Обработка первичной взвеси производится методом сепарирования или центрифугирования в комбинации с эфирной обработкой. Осадок после третьего сепарирования состоит обычно из чистых риккетсий. Сепарированием и эфирной обработкой достигается отделение риккетсий от тканевых примесей.
Риккетсиозная взвесь стандартизуется по оптическому бактерийному стандарту и доводится путем разведения стерильным физиологическим раствором с 5 % сахарозы до концентрации, соответствующей мутности 2 млрд. микробных тел в 1 мл. Стандартизованная взвесь разливается в ампулы по 0,5 мл, замораживается при t -20... -25°С и высушивается в вакууме. Риккетсиозный антиген подвергается контролю на растворимость, правильность стандарта, ставятся реакции агглютинации и связывания комплемента с типовой иммунной сывороткой, проводится микроскопический контроль на отсутствие бактериального загрязнения. Сухой антиген хранится при температуре +4... +10°С. Он годен в течение 2,5 лет.
Для серологической диагностики некоторых риккетсиозов, например, исторического сыпного тифа, применяется антиген из риккетсий, культивированных в кишечниках вшей.
Для изготовления антигена используется несколько штаммов риккетсий Провачека, выделенных от больных сыпным тифом. Этими штаммами заражают с помощью микроклизмы взрослых, здоровых платяных вшей. До момента гибели их кормят один раз в день на донорах, перенесших сыпной тиф или привитых.
Зараженные вши погибают в сроки от четвертого до восьмого дня. После гибели их помещают в 0,5 % фенол, через 2-3 дня вскрывают, отсепарировают кишечники, растирают их в ступке с физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола, затем взвесь центрифугируется или оставляется для осаждения крупных частиц.
Антиген представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых фенолом риккетсий Провачека, культивированных в кишечниках зараженных вшей. Он содержит в 1 мл 3-5 млрд. риккетсий (50-60 кишечников зараженных вшей).
Для предупреждения порчи от замерзания во время транспортировки в некоторые серии добавляют 10 % глицерина; это не отражается на специфической активности препарата, но делает его более морозоустойчивым. Готовый антиген проверяют на агглютинабильность сыворотками сыпнотифозных больных или типовыми иммунными сыворотками и сыворотками здоровых людей. Готовый антиген испытывается на специфическую стерильность путем внутрибрюшинного введения 2 мл взвеси осадка антигена морским свинкам или вшам по методу Вейгля. У свинок ежедневно измеряют температуру. Если у них не отмечается повышения температуры, антиген считается специфически стерильным. При заражении вшей микроскопическое исследование мазков из кишечников проводится с 6-го по 10-й день, в мазках не должны обнаруживаться риккетсии.
Готовый диагностикум разливается в ампулы по 1,5 или 10 мл. Срок годности равен 1 году. Препарат проходит контроль на стерильность, соответствие стандарту и агглютинабильность.
Применяется в реакции макроагглютинации. Характер агглютинации риккетсий мелкозернистый. Реакция высокоспецифична. Положительный результат 1:40 + + + + считается диагностическим титром.
В разведенном виде препарат можно применять для реакции связывания комплемента.
Помимо вышеперечисленных антигенов для диагностики эпидемического сыпного тифа и крысиного риккетсиоза применяется антиген, приготовленный из легких белых мышей, зараженных риккетсиями Провачека и Музера.
Богатые риккетсиями мышиные легкие размельчаются в ступке с кварцевым песком и разводятся формалинизированным физиологическим раствором из расчета 3-4 мл на легкое.
Далее формалинизированная взвесь центрифугируется дважды: один раз при 1500 оборотах в минуту для удаления тканевых примесей, другой раз при 3000 оборотах в минуту для получения риккетсий в осадке. Осадок обрабатывается физиологическим раствором, содержащим 0,4 % формалина и 0,5 % фенола.
В дальнейшем он подвергается обработке эфиром, после чего к нему добавляется сахароза и производится высушивание из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.
Готовый препарат представляет собой сухой антиген из хорошо очищенных убитых формалином риккетсий, подвергнутый контролю по вышеописанной методике.
Вирусные диагностикумы - антигены
Вирусные диагностикумы представляют собой антигены, используемые для серологических реакций. В зависимости от цели применения их подразделяют на антигены для реакции связывания комплемента и антигены для реакции торможения гемагглютинации.
Для изготовления диагностикумов из разных вирусов используются преимущественно следующие инфицированные материалы: для вируса гриппа - аллантоисная жидкость, для эпидемического паротита - амниотическая или аллантоисная жидкость, для орнитозов и лимфогранулемы - желточные мешки куриных эмбрионов, для вирусов энцефалитов - мозговая ткань мышей, куриных эмбрионов или культура тканей, для аденовирусов и полиомиелита - культуральные жидкости. Диагностикумы из аллантоисной и амниотической жидкости употребляют в нативном виде, другие - требуют специальной сложной обработки, так как обладают антикомплементарными свойствами.
Методы обработки антигенов делятся на физические и физико-химические. Из физических методов наибольшее применение имеет метод повторного замораживания и оттаивания, т.е. термолизис. Из физико-химических методов - обработка эфиром и хлороформом.
Метод термолизиса заключается в следующем: готовится 10 % суспензия на физиологическом растворе из инфицированной ткани, куда добавляется 2 % инактивированной сыворотки морской свинки. После 18-20 часового экстрагирования при 4 °С крупные тканевые частицы удаляют путем центрифугирования в течение 30 минут при 2500 оборотах. Надосадочная жидкость подвергается пятикратному замораживанию (при -7 °С) и оттаиванию (при +7 °С). Затем жидкость центрифугируют в течение часа при 3500 оборотах в минуту. Приготовленный таким образом диагностикум представляет собой слегка опалесцирующую жидкость.
Обработка вирусных диагностикумов физико-химическим методом заключается в том, что готовят суспензию, как описано выше для термолизиса, к ней добавляют полуторный объем эфира или хлороформа и в течение 2 часов производят встряхивание. Материал помещают на 18 часов в холодильник при 4 °С. Затем центрифугируют в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. Происходит расслоение суспензии. В случае обработки эфиром антиген будет в нижнем слое, а при обработке хлороформом - в верхнем. Готовый антиген по внешнему виду представляет прозрачную жидкость. Вирусные диагностикумы не должны содержать живых вирусов. Инактивирование их производится либо прогреванием (37 °С), либо действием химических веществ (формалин, бетапропиолактон).
Существует значительное количество модификаций приготовления антигенов применительно к тому или иному вирусу. Выпускаются вирусные, антигены для диагностики следующих заболеваний: японского и клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, орнитозов, гриппа и эпидемического паротита, венесуэльского энцефаломиелита, западного энцефаломиелита лошадей, аденовирусных инфекций и др.
При многих инфекционных заболеваниях изменяется реактивность организма к возбудителю инфекции или его продуктам. Такая измененная реактивность организма называется инфекционной аллергией.