Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Глава 11. АГГЛЮТИНИРУЮЩИЕ, ПРЕЦИПИТИРУЮЩИЕ, ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ И ЛЮМИНИСЦИРУЮЩИЕ СЫВОРОТКИ. КОМПЛЕМЕНТ
Диагностические иммунные сыворотки широко применяются для определения вида или типа микроба, выделенного от больного или носителя и для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии. Приготовление диагностических сывороток в принципе не отличается от приготовления лечебно-профилактических сывороток. В зависимости от характера антигена, послужившего для иммунизации животного, сыворотка последнего приобретает различные свойства.
Специфические свойства иммунных сывороток могут быть обнаружены путем изучения действия их на соответствующие антигены. В зависимости от условий опыта у таких сывороток можно наблюдать агглютинирующее (склеивающее), преципитирующее (осаждающее) и литическое (растворяющее) действие. Применительно к наблюдаемым феноменам принято говорить о соответствующих иммунных телах, содержащихся в сыворотках: агглютининах, преципитинах, лизинах и пр.
Агглютинирующие сыворотки
При идентификации микробов, наряду с определением морфологических, культуральных и биохимических свойств их, широко используются диагностические агглютинирующие сыворотки. Агглютинацией называется склеивание микробов, скучивание их под влиянием специфических антител - агглютининов, содержащихся в иммунной сыворотке.
Реакция агглютинации в настоящее время является наиболее часто применяемой, нередко единственной в смысле определения и выделения различных видов из группы морфологически неотличимых бактерий. Микробная клетка является сложным комплексом антигенов, что является причиной так называемой групповой агглютинации, выражающейся в том, что иммунная сыворотка агглютинирует не только гомологичный микроб, но и другие бактерии из той же группы. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба и серологическую диагностику заболевания.
Устранить групповую агглютинацию можно, удалив из сыворотки антитела в отношении антигенов, являющихся общими для гомологичного микроба и для родственных с ним. Это достигается путем смешения небольшого количества сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что ведет к адсорбции на их поверхности соответствующих антител. В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба.
Иммунные сыворотки, лишенные антител к групповым антигенам и сохранившие лишь антитела к тому специфическому антигену, которым характеризуется гомологичная культура, получили название монорецепторных.
Антитела, обусловливающие агглютинацию бактерий и иных клеток, получили название агглютининов, а сыворотки, содержащие эти антитела, агглютинирующих. Сыворотки получаются путем иммунизации животных соответствующими микробами. В качестве продуцентов агглютинирующих сывороток могут быть использованы кролики, бараны, козы, ослы и лошади. Наиболее свободными от неспецифических антител являются сыворотки кроликов.
Для иммунизации животных можно применять живые и убитые культуры, являющиеся типичными по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, серологическим и антигенным свойствам. Лучшие результаты получаются при применении формалинизированных и обработанных парами формалина микробных взвесей. Иммунизацию проводят путем введения антигена в краевую ушную вену, начиная с 500 млн. микробных тел в 1 мл и увеличивая дозу вдвое при последующих введениях. Для получения полноценных сывороток обычно бывает достаточно 3-4 инъекций с интервалами в 5 дней. На 5-7 день после третьей иммунизации берется проба крови и проверяется титр сыворотки. Титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, с которым получается реакция агглютинации соответствующей культуры, оцениваемая тремя крестами при помощи агглютиноскопа. При получении недостаточного титра, кролик подвергается 4-й иммунизации в той же дозе или в удвоенной, в зависимости от веса и состояния животного.
Если титр сыворотки оказывается достаточным, то в тот же день у кролика производится кровопускание. Кровь можно получить тремя способами:
1) из ушной вены;
2) из сердца;
3) из сонной артерии (тотальное кровопускание).
На наружной поверхности уха в месте сплетения кровеносных сосудов делается надрез бритвенным ножичком и кровь по каплям собирается в большую стерильную пробирку. После взятия крови кролику подкожно вводится стерильный физиологический раствор (не менее половины объема взятой крови). Взятие крови из уха кролика следует производить 2 раза с интервалом в 2 дня. За два кровопускания от одного кролика получается 80-120 мл крови.
Взятие крови из сердца производится однократно, в количестве 40-60 мл. Козам, ослам и баранам антиген первый раз вводится подкожно, а в дальнейшем внутривенно, с интервалами в 5 дней. У крупных животных (бараны, козы, ослы, лошади) кровопускание производится через яремную вену.
Полученная кровь ставится на 10-15 минут в термостат, образовавшийся сгусток отделяется от стенок пробирки, после чего кровь выдерживается в течение 24-48 часов в рефрижераторе при температуре 4-8 °С. В настоящее время от крупных животных (лошади, ослы и др.) кровь берут в бутыли с цитратным раствором. Плазму дефибринируют раствором хлористого кальция.
К полученной сыворотке добавляется консервант. Сыворотка (в нативном виде) выдерживается не менее 1 месяца при температуре 4-8 °С для стабилизации титра, после чего определяется окончательный титр ее к гомологичным штаммам и. наличие групповой реакции путем постановки реакции агглютинации с набором соответствующих живых культур в количестве 3-5 штаммов каждого вида. Титр групповых агглютининов не должен превышать 1/8 титра к гомологичным культурам.
Институтами вакцин и сывороток выпускаются неадсорбированные и адсорбированные агглютинирующие сыворотки. Специфические адсорбированные агглютинирующие сыворотки получают путем удаления методом адсорбции неспецифических и групповых антител из нативных сывороток. Использование адсорбированных сывороток дает возможность определения выделенного микроба в пределах вида или типа при помощи реакции агглютинации на стекле без дополнительной постановки развернутой агглютинации.
Для адсорбции агглютинирующих сывороток в качестве адсорбента могут применяться живые и убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью обладает живая культура, содержащая все антигенные компоненты в неизмененном виде. Полученные микробные взвеси перед употреблением центрифугируются в необходимом количестве и добавляются к адсорбируемой сыворотке. Адсорбцию сывороток следует начинать адсорбентами, имеющими близкое родство с культурой, примененной для получения данной сыворотки. Количество добавленного антигена зависит от вида или типа истощаемой сыворотки и от ее количества.
Сыворотка с адсорбентом помещается в термостат при 37 °С на срок от 2 до 18 часов и затем в рефрижератор до следующего дня. Истощаемая сыворотка после каждой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение, так и с культурами, реагировавшими с ней при первоначальном контроле, а также с гомологичными, культурами.
Полностью адсорбированные сыворотки освобождаются от микробных тел путем центрифугирования или сепарирования. Если к нативной сыворотке не добавлялся консервант, то к полученной серии сыворотки следует добавить 1-2 % перекристаллизованной борной кислоты. Затем сыворотка фильтруется через стерилизующий бактериальный фильтр и после выдерживания в течение 2-х суток при комнатной температуре испытывается на стерильность, специфичность и высоту титра.
Контроль на специфичность адсорбированных агглютинирующих сывороток проводится до и после фильтрования - реакцией агглютинации на стекле и развернутой реакцией агглютинации с гомологичными и гетерологичными культурами. Ясно выраженная положительная реакция агглютинации, получаемая с 3-5 гомологичными культурами в течение 1 минуты при комнатной температуре, при отсутствии реакции агглютинации с культурами других серологических типов в течение 20 минут служит критерием для выпуска адсорбированных сывороток. Диагностические агглютинирующие сыворотки разливаются по 1 мл в соответствующие ампулы, которые упаковываются по нескольку штук (не более 10) в коробку.
Агглютинирующие сыворотки необходимо хранить в темном сухом месте при 4-10 °С. При правильном содержании сыворотка сохраняет свою активность в течение одного года со дня изготовления.
Агглютинирующие адсорбированные сыворотки выпускаются и в сухом виде. Сыворотки перед высушиванием в стерильных условиях разводят сахарозо-желатиновой средой, разливают по 1 мл в стерильные ампулы и высушивают из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.
Преципитирующие сыворотки
Преципитирующие сыворотки применяются для постановки реакций преципитации с целями диагностики некоторых инфекционных заболеваний, для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии, в судебно-медицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови, в санитарии, химии и т.д.
Реакция преципитации характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить ничтожные следы антигена (до разведения 1:100000 и выше). Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих.
Преципитирующие сыворотки получаются путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток. Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, а также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.
Наилучшие преципитирующие сыворотки получаются при иммунизации полным антигеном или соляно-кислой вакциной. Применяемую для иммунизации животных экстрагированную соляно-кислую вакцину готовят следующим образом: густой смыв суточной культуры дважды промывают (при центрифугировании) физиологическим раствором и обрабатывают десятикратным количеством 0,2 N соляной кислоты в течение 18-24 часов при температуре 37 °С. Затем центрифугируют, полученный осадок микробных тел дважды промывают физиологическим раствором и нейтрализуют 25 % раствором углекислой соды. Полученную вакцину оставляют в виде осадка.
По мере надобности из этого осадка готовят взвесь в физиологическом растворе, содержащую необходимое для иммунизации количество микробных тел, определяемое по оптическому стандарту. При такой обработке в вакцине остается часть полного антигена и происходит разрушение лабильных токсических белков, в результате чего сохраняется антигенность и достигается относительная атоксичность препарата.
Преципитирующие сыворотки готовятся подобно агглютинирующим, только выпускаются они с высокими титрами, не ниже 1:100000, что достигается более длительной иммунизацией животных. Небольшие дозы (0,5 мл) антигена вводятся в течение 2-3 недель по 3 дня подряд с перерывом в 4 дня. Более массивные дозы (1-2-3 мл) вводятся с интервалами в 4-6 дней по 8-12-16 раз. Значительной эффективностью обладает разделение иммунизации на несколько циклов, из которых один производится внутривенно (6-8 инъекций по 1-2 мл), а другой - крупными дозами внутрибрюшинно (6-8 инъекций по 3-5 мл). Кровопускание производится на 8-12-й день после последнего введения антигена. Полученная сыворотка консервируется добавлением 1-2 % сухой борной кислоты или 0,5 % хлороформа. Готовый препарат контролируют на специфичность, стерильность и высоту титра. При титровании преципитирующей сыворотки определяется то предельное разведение антигена, которое может быть обнаружено при помощи цельной или разведенной иммунной сыворотки.
Гемолитическая сыворотка
Гемолитическая сыворотка представляет собой сыворотку кролика, иммунизированного отмытыми эритроцитами барана. Гемолитическая сыворотка самостоятельно для серологического диагноза инфекционных болезней не применяется, а используется как составная часть гемолитической системы при постановке реакции связывания комплемента.
Иммунизация кроликов проводится отмытыми эритроцитами барана с интервалами в 48 часов. Каждый кролик получает в ушную вену 4 инъекции бараньих эритроцитов в повышающейся концентрации:
1 инъекция-3 мл 25 % взвеси бараньих эритроцитов,
2 инъекция-3 мл 50 % взвеси бараньих эритроцитов,
3 инъекция-3 мл 75 % взвеси бараньих эритроцитов,
4 инъекция-3 мл 75 % взвеси бараньих эритроцитов.
Через 6 дней после последней инъекции у кроликов берется кровь из ушной вены в два приема с интервалом в один день в количестве 60-80 мл. Кровь оставляется при комнатной температуре на 1-2 часа, затем при температуре 3-6 °С на 20-24 часа. На следующий день сыворотку отсасывают после центрифугирования в стерильную колбу.
Полученная гемолитическая сыворотка инактивируется 30 минут при 55-56 °С и консервируется добавлением сухой борной кислоты из расчета 3 % или карбол-глицерина из расчета 100 мл консерванта на 1 литр сыворотки.
Консервированная сыворотка выдерживается в леднике в течение 5 дней, после чего титруется.
Титром гемолитической сыворотки называется се максимальное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3 % взвеси бараньих эритроцитов в присутствии 0,5 мл разведенного комплемента в течение 1 часа при температуре 37 °С.
Гемолитическая сыворотка должна быть прозрачной с титром не ниже 1:1200, способной лизировать бараньи эритроциты только в присутствии комплемента. Гемолитическая сыворотка разливается в ампулы емкостью 1-2 мл и хранится при температуре 3-5 °С. Срок годности 6 месяцев.
Антивирусные сыворотки
Диагностические антивирусные сыворотки получили широкое распространение для определения вида и типа выделенного вируса. Изготовление антивирусных диагностических сывороток не отличается от изготовления антибактериальных.
Получение антивирусных сывороток проводят на определенном виде животных (кролики, морские свинки, крысы и др.), что связано с особенностями того или иного вируса. Животные, чаще кролики, иммунизируются живым или инактивированным вирусом:
После нескольких иммунизаций у животных берут кровь и определяют количество антител в сыворотке. Сила диагностической противовирусной сыворотки определяется ее титром, т.е. наибольшим разведением, дающим соответствующую реакцию иммунитета.
Диагностические антивирусные сыворотки используются в постановке реакций преципитации, связывания комплемента, нейтрализации вируса и реакции торможения гемагглютинации. Наибольшее распространение получили реакции нейтрализации, связывания комплемента и торможения гемагглютинации.
Люминесцирующие сыворотки
Люминесцирующие сыворотки применяются для микробиологической диагностики ряда инфекционных заболеваний, а именно для обнаружения бактерии, вирусов, риккетсий и простейших, для определения локализации антигенов в организме, тканевых срезах и пр. Во многих микробиологических исследованиях широко используется метод люминесцирующих антител. Этот метод, основанный на сочетании иммунологической специфичности реакции между антигеном и антителом и люминесцентной микроскопии, позволяет обнаруживать и идентифицировать бактерии, вирусы, риккетсии, грибки, простейшие и растворенные антигены в микроскопическом препарате.
Люминесцентно-серологический метод обладает высокой чувствительностью, достаточно специфичен, отличается простотой проведения и позволяет быстро получить ответ.
Люминесцирующие сыворотки готовят из специфических иммунных сывороток, которые в свою очередь получают подобно агглютинирующим и преципитирующим сывороткам. Из них извлекают глобулиновую фракцию методом высаливания сернокислым аммонием. Полученные глобулины обрабатывают флюорохромами, изоцианатом флюоресцеина или изотиоцианатом флюоресцеина в соотношении 3 мг красителя на 100 мг белка. Обработанные таким образом белки-антитела обладают способностью люминесцировать (светиться) в ультрафиолетовых или фиолетово-синих лучах. Такие люминесцирующие антитела используются для обнаружения соответствующего микроба (антигена). Наличие и локализация микробов (антигена) в микроскопическом препарате выявляются в результате реакции антиген - антитело. Продукт этой реакции ярко люминесцирует и может быть открыт даже в отдельных участках клеток и в единичных бактериях. Единичные клетки возбудителей могут быть идентифицированы в мазках па фоне обильной посторонней микрофлоры.
Помимо описанных люминесцирующих сывороток в микробиологической практике широко применяются люминесцирующие нормальные сыворотки разных видов животных и человека. Эти сыворотки используются при непрямом методе определения антигенов и антител. Они служат для обнаружения комплексов антиген 4-антитело и являются антисыворотками против глобулинов сыворотки того вида животного, которое иммунизировалось для получения специфической сыворотки. В основном применяется люминесцирующая противокроличья сыворотка, иногда люминесцирующие противолошадиная и противочеловеческая сыворотки.
Непрямой метод использования люминесцирующих антител заключается в том, что на препарат, содержащий микроба (антиген), наносят специфическую иммунную сыворотку. Молекулы гамма-глобулинов из примененной сыворотки, взаимодействуя с гомологичным антигеном, специфически адсорбируются в местах локализации его и обнаруживаются с помощью люминесцирующей антигамма-глобулиновой сыворотки.
Получение люминесцирующей противокроличьей или противолошадиной сывороток осуществляется путем иммунизации петухов (в первом случае) или кроликов, ослов гамма-глобулиновой фракцией нормальной сыворотки. Полученная видовая иммунная сыворотка обрабатывается флуорохромами.
Люминесцирующие диагностические сыворотки, высушенные методом лиофильной сушки, сохраняют свою активность при комнатной температуре более года.
В настоящее время разработаны методы производства люминесцирующих глобулинов: антирабического, сыпно-тифозного, Ку-риккетсиозного, бруцеллезного, туляремийного, сибиреязвенного, противочумного, дизентерийного (Зонне и Флекснера), холерного и др., а также люминесцирующих антисывороток, против глобулинов кролика, морской свинки, лошади, барана и человека - для непрямого иммунолюминесцентного метода.
Комплемент
Комплемент - это совокупность нескольких нормальных компонентов свежей сыворотки с различными физико-химическими свойствами. Природа комплемента не вполне ясна.
Он содержится в большинстве сывороток теплокровных и холоднокровных животных. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотке морских свинок, поэтому последние и служат в лабораториях донорами комплемента.
Основным свойством комплемента является его способность вызывать лизис клеток, сенсибилизированных соответственными иммунными сыворотками, а также адсорбироваться системами антиген + антитело.
Комплемент широко применяется в медицинской и ветеринарной практике для серологической диагностики ряда инфекционных заболеваний в постановке реакции связывания комплемента (сифилис, гонорея, бруцеллез, сап, туляремия, проказа, актиномикоз, риккетсиозы, грипп, клещевой энцефалит и др.).
Для получения комплемента используются морские свинки весом 400-600. Кровь у них берут из сердца в количестве 6-8 мл, после чего подкожно вводят физиологический раствор. Взятие крови у одной и той же морской свинки производится не чаще 1 раза
в 15-20 дней. Для получения одной серии комплемента делается смесь сыворотки от 30-50 свинок. Обработка крови для получения сыворотки производится обычным, описанным выше
способом.
Консервантом в жидком комплементе является смесь из 4,5 % раствора борной кислоты и сернокислого натрия. Сила комплемента определяется его титром, т.е. наименьшей дозой, способствующей полному гемолизу 1 мл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Для постановки реакций иммунитета (гемолиз, бактериолиз, РСК) берут рабочую дозу комплемента, которая на 20-30 % превышает вытитрованную минимальную дозу, так как в реакциях активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами (антигеном, сывороткой).
Комплемент пригоден к отпуску при титре от ОД до 0,25 в разведении 1:10. Он должен быть прозрачным, негемолизированным, обладать способностью адсорбироваться комплексом антиген + антитело и не быть гемотоксичным.
Комплемент выпускается в жидком виде со сроком годности в 2 месяца при условии хранения при температуре 3-6 °С и в высушенном состоянии со сроком годности в 3-4 года.
Препарат сухого комплемента сохраняется при обычной комнатной температуре.