Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

АКТИВАЦИЯ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ КАК ВЕДУЩИЙ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ФАКТОР РАЗВИТИЯ ТИПОВЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И ЗАБОЛЕВАНИЙ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ

Попков В. М., Чеснокова Н. П., Ледванов М. Ю.,

4.2.1. Особенности цитопатогенного действия токсинов возбудителей холеры. Их роль в активации процессов липопероксидации в механизмах нарушений коагуляционного гемостаза и реологических свойств крови при холерной интоксикации

Холера представляет собой острое диарейное заболевание, индуцируемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae серогруппы 01, включающей классический биовар Эльтора, а также серогруппы 0139.

Характерной особенностью холерных вибрионов является их способность заселять тонкий кишечник с последующим развитием острого воспалительного процесса и диареи. Селективность повреждения тонкого кишечника обусловлена продукцией возбудителями холеры адгезивных молекул, включающих токсинорегулируемые пили (toxin coregulated pilus) или TCP, маннозофукорезистентные и маннозочувствительные гемагглютинины–адгезины, а также белки внешней мембраны с выраженными адгезивными свойствами.

Как стало очевидно в последние годы, TCP – это белок, состоящий из повторяющихся субъединиц с ММ 20,5 кД, продуцируемый серогруппами возбудителей холеры 01 и 0139. Обнаружены определенные различия аминокислотных последовательностей TCP различных серогрупп и биоваров Vibrio cholerae [17]. Вслед за адгезией к энтероцитам и колонизацией тонкого кишечника Vibrio cholerae возникают интенсивная продукция и секреция холерного токсина – СТ (Cholera toxin).

Описание структуры и биологических свойств холерного токсина приведено в ряде монографий и обзорных работ [4, 8, 11, 10, 17].

В настоящее время известно, что СТ – белок с ММ 84 кД, состоящий из 1 субъединицы А и 5 субъединиц В. Субъединица А с ММ 27,2 кД состоит из 2 пептидов – А1 и А2, отвечающих за токсическую активность всей молекулы.

Комплекс В–субъединиц (ММ 58 кД) обеспечивает связывание токсина с клеточным рецептором – ганглиозидом Gm1 энтероцитов, несет антигенные детерминанты, вызывает развитие мукозальных иммунных реакций и синтез IgA.

В последние годы описаны два семейства токсинов (ST), являющихся причиной диареи при кишечных инфекциях (STа и STв). STа–токсины продуцируются самыми разнообразными бактериями, вызывающими заболевания желудочно-кишечного тракта: энтеротоксигенными E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus, Yersinia enterocolitica, Citobacter freundii, Klebsiella spp.

STа транслируются в виде молекулы – прекурсора, которая после двукратного расщепления в процессе созревания выделяется во внешнюю среду. Зрелые ST – небольшие пептиды, содержащие от 19 до 53 аминокислотных остатков. Токсины, относящиеся к семейству STа, имеют на С-конце последовательность из 13 аминокислотных остатков, определяющую токсичность и термостабильность токсина. 6 остатков цистеина, объединенных 3 дисульфидными мостиками в составе данного домена, обусловливают токсичность этой молекулы.

Связывание STа со специфическим клеточным рецептором приводит к активации мембраноассоциированной гуанилатциклазы, которая, в свою очередь, превращает внутриклеточный ГМФ в циклический ГМФ. Возрастание в энтероцитах уровня ц-ГМФ сопровождается подавлением адсорбции ионов натрия и увеличением секреции ионов хлора. Изменение ионных потоков приводит к развитию секреторной диареи [8].

Вышеизложенное делает очевидным, тот факт что «специфичность» патогенного действия холерного токсина весьма относительна и характерна для токсинов ряда энтеропатогенных возбудителей диарейных заболеваний.

Как известно, особенностями холерной инфекции являются взаимопотенцирующие эффекты холерного токсина и эндотоксина (ЛПС), а также ферментных факторов патогенности, продуцируемых возбудителями холеры.

Ферменты холерного вибриона представляют собой термолабильные белки. Наиболее значимыми в дезорганизации биологических мембран и межклеточного матрикса в динамике холерной инфекции являются протеаза, коллагеназа, эластаза, фибринолизин, муциназа, амилаза [1, 2].

Касаясь молекулярно-клеточных механизмов патогенного действия основных токсических факторов возбудителей холеры, следует отметить ряд общепринятых концепций и современные взгляды относительно цитокинопосредованных биологических эффектов холерных токсинов. Установлено, что цитопатогенные эффекты холерного токсина связаны прежде всего с его способностью фиксироваться на клеточных рецепторах энтероцитов, включающих ганглиозид Gm1.

Однако рецепция холерного токсина может осуществляться и другими клеточными элементами, в частности, клетками печени, щитовидной железы, жировыми клетками, эритроцитами, тромбоцитами.

В течение 30 минут после контакта экзотоксина с рецептором происходят образование комплекса токсинганглиозид, гидролиз токсина на субъединицы А и В, формирование в мембране клеток канала при участии В–пептидных цепей и рецептора, транслокация токсической субъединицы А по указанному каналу на внутреннюю поверхность мембраны клеток с последующей диссоциацией ее на пептидные цепи [11, 17].

Пептид субъединицы А холерного токсина представляет собой фермент АДФ-рибозилтрансферазу, который катализирует отщепление АДФ–рибозы от НАД и перенос ее на белки, регулирующие функции других ферментов, в частности, ГТФ-азу. После АДФ-рибозилирования ГТФ-аза утрачивает специфическую активность, образует комплекс с ГТФ, обеспечивающий активацию аденилатциклазы и резкое увеличение цАМФ в энтероцитах [1, 2].

Значение цАМФ в развитии мукозального адъювантного ответа под влиянием холерного токсина отмечено и в более поздней работе.

Таким образом, сопоставляя приведенные выше данные, следует отметить две точки зрения на механизмы развития холерной диареи: либо через увеличение активности мембраноассоциированной гуанилатциклазы и уровня цГМФ в энтероцитах, либо за счет активации аденилатциклазной системы и возрастания в клетках цАМФ. Не исключена возможность взаимодействия двух указанных механизмов, индуцируемых холерным токсином.

Известно, что в динамике заболевания холерой биологические эффекты холерного токсина потенцируются при участии ЛПС. Детальная характеристика молекулярно-клеточных механизмов действия ЛПС представлена выше. Установлено, что токсичность О-антигена холерного вибриона коррелирует с содержанием глюкозамина [3].

В последнее время появились данные о том, что биологические эффекты ЛПС и холерного токсина опосредуются за счет внутриклеточного образования стереотипных мессенджеров, причем большинство экспериментов было выполнено в указанном направлении с использованием возбудителя холеры серогруппы 01. Однако в последнее время показана цитокинопосредованная патогенность и для возбудителей холеры серогруппы 0139 [21]. Так, при изучении влияния ЛПС и холерного токсина на активность макрофагов установлено, что каждый из токсинов индуцировал выделение ИЛ-1-бета. Вместе с тем выявлены и особенности их действия. ЛПС индуцировал выделение IL-12, а холерный токсин – экспрессию CD80–86 [19]. В другой работе установлена дозозависимая стимуляция синтеза IL-12 и TNF-альфа макрофагами под влиянием холерного ЛПС. Использование миметика ц-АМФ блокировало синтез обоих цитокинов макрофагами, подвергаемыми микробной стимуляции. В то же время установлено, что холерный токсин индуцирует образование мукозальными эпителиальными клетками цитокинов – Il-1, IL-6, IL-8, а также вызывает образование макрофагами IL-1 и IL-12 [20].

Между тем, IL-12 оказывает адъювантное действие на антигенные свойства холерного токсина, усиливает его эффекты на образование интерферона-гамма и IL-10 в легких и селезенке.

Показано, что инкубация альвеолярных макрофагов с холерным токсином ингибировала как базальную, так и ЛПС-стимулированную активность фосфолипазы А2. В последнее время описан ИЛ-17, полученный из Т-клеток. Оказалось, что холерный токсин, подобно Pg E2 и миметикам цАМФ, подавляет IL-17-индуцированное освобождение TNF-альфа.

В работах последних лет установлено, что при участии А-компонента холерного токсина обеспечивается дозозависимое ингибирование продукции IL-12 макрофагами на уровне генной транскрипции. В то же время очищенный В–компонент токсина оказывает менее выраженное аналогичное действие. Холерный токсин ингибирует выделение TNF моноцитами, но не влияет на выделение IL-10, IL-6, Pg E2.

Проявлениями биологического действия холерного токсина являются дыхательный «взрыв» макрофагов и усиление активности NO–синтазы. Добавление холерного токсина к клеточным ячейкам одновременно с ЛПС усиливает выделение TNF–?. При инактивации холерного токсина нагреванием или моноклональными антителами этот эффект исчезал.

Резюмируя в целом приведенные выше данные, следует заключить, что «специфические» патогенные эффекты возбудителей холеры обусловливаются лишь на начальных этапах развития инфекционного процесса за счет способности Vibrio cholerae продуцировать определенный комплекс молекул адгезии и колонизировать тонкий кишечник с последующей рецепцией холерного токсина Gm1 рецепторами энтероцитов. Дальнейшее развитие воспалительно-деструктивного процесса в тонком кишечнике обеспечивается комплексом биологически активных веществ и цитокинов, при посредстве которых формируются системные метаболические сдвиги, расстройства микроциркуляции в различных органах и тканях, развитие синдрома полиорганной недостаточности.

Обращает на себя внимание тот факт, что в динамике развития холеры, наряду с доминирующим в клинике диарейным синдромом, возникают резкие нарушения коагуляционного потенциала, реологических свойств и клеточного состава периферической крови.

Как показали результаты экспериментов, проведенных на различных моделях холерной интоксикации, общими закономерностями расстройств гемостаза при холерном эндотоксикозе у высокочувствительных и относительно резистентных животных являются развитие прогрессирующей недостаточности внутреннего и внешнего механизмов формирования активности протромбиназного фактора, активация антикоагулянтных механизмов и системы фибринолиза, истощение запасов фибриногена на ранних стадиях холерной интоксикации, индуцируемой введением ЛПС или сочетанным воздействием токсинов возбудителей холеры.

Развитие холерного эндотоксикоза у высокочувствительных животных сопровождается формированием более глубоких и пролонгированных сдвигов коагуляционного потенциала крови, чем у относительно резистентных животных, вплоть до полного истощения внутреннего и внешнего механизмов формирования активного протромбиназного комплекса, развития афибриногенемии.

Холерный энтеротоксин при комплексном воздействии его с холерным ЛПС на высокочувствительных животных оказывает выраженный модулирующий и потенцирующий эффекты на сдвиги коагуляционного потенциала крови, свойственные ЛПС – интоксикации. На фоне комбинированного введения токсинов высокочувствительным животным возникает более выраженный дефицит плазменных факторов свертывания крови, обеспечивающих каскадную активацию протромбиназы, а также истощение активаторов плазминогена и запасов фибриногена.

На различных моделях холерной интоксикации показано, что в роли индуктора системных расстройств микроциркуляции, гемореологии, коагуляционного потенциала крови выступает эндотоксин. Системные патогенные эффекты эндотоксина усиливаются воздействием эндотоксина, обеспечивая в то же время сенсибилизацию кишечника к повреждающему воздействию холерогена за счет дегрануляции тучных клеток и освобождения вазогенных провоспалительных цитокинов [12, 13, 26, 27, 28, 29].

В динамике холерной интоксикации, индуцируемой введением ЛПС или сочетанным воздействием токсинов на высокочувствительных и относительно резистентных животных, выявлена однотипная закономерность снижения вязкости цельной крови, обусловленная рядом патогенетических факторов: дефицитом фибриногена и снижением вязкости свойств плазмы, развитием эритропении, нарушением структуры липидного бислоя эритроцитарных мембран, появлением «жестких» эритроцитов с низкой осмотической резистентностью [14, 28, 29].

Нарушения реологических свойств крови при холерной ЛПС-интоксикации у высокочувствительных животных в достаточной мере обратимы. Оптимальный эффект коррекции вязкостных свойств крови и состояния эритроцитарных мембран достигнут при комплексном использовании глюкокортикоидов, антиоксидантов, мембранопротекторов, ингибиторов протеаз [13, 14].

Ведущая роль в патогенезе расстройств коагулогемостаза и реологических свойств крови при холере в соответствии с результатом проведенных нами экспериментов должна быть отведена активации свободнорадикального окисления и соответственно системной дезинтеграции биологических мембран.

Как оказалось, холерная ЛПС–интоксикация характеризуется активацией процессов липопероксидации, сочетающейся у относительно резистентных животных с дозозависимой недостаточностью ферментного звена антиоксидантной системы, а у высокочувствительных к действию ЛПС животных – с прогрессирующей активацией ферментов антиоксидантной системы. Холерный токсин оказывает модулирующее воздействие ЛПС на активность СОД и каталазы при сочетанном воздействии токсинов на относительно резистентных и высокочувствительных животных, не влияя существенно на уровень продуктов липопероксидации в крови [12, 13, 14, 26, 27, 28, 29].

Достигнута положительная динамика патоморфологических сдвигов микроциркуляции, а также гемореологии и активации процессов липопероксидации в динамике холерной интоксикации, индуцируемой комплексным введением ЛПС и экзотоксина или ЛПС под воздействием мембранопротекторов, антиоксидантов, препаратов антипротеазного действия, адреномодуляторов. Последнее указывает, с одной стороны, на патогенетическую значимость активации процессов липопероксидации в механизмах потенцирования цитопатогенных эффектов холерных токсинов, а с другой стороны – открывает перспективы в использовании новых принципов медикаментозной коррекции метаболических и гемореологических сдвигов при холерной инфекции и интоксикации.

Единый принцип структурной организации эндотоксинов грамотрицательных бактерий, ведущая роль ЛПС в механизмах системных патогенных эффектов возбудителей холеры позволяют экстраполировать лишь с определенной долей вероятности обнаруженные нами закономерности расстройств гемостаза, фибринолиза, микроциркуляции, гемореологии, активации процессов липопероксидации, а также возможности их медикаментозной коррекции на системную эндотоксемию другой бактериальной природы. Необходимо учитывать тот факт, что при различных грамотрицательных инфекциях возникает модификация цитопатогенных эффектов эндотоксина под влиянием других ферментных и токсических факторов патогенности, что придает определенную «специфику» структурным, метаболическим и функциональным сдвигам, свойственных тому или иному инфекционному заболеванию.

Указатель основной литературы

1. Адамов А.К. Иммунология холеры. – Саратов: Изд–во Саратовского ун–та, 1981. – 320 с.
2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы.– Саратов: Изд–во Саратовского ун–та, 1984. – 328 с.
3. Громова О.В., Захарова Т.Л., Грачева В.П. // Микробиол., биохим. и специфич. профилактика карантийных инфекций. – Саратов, 1990. – С. 122–126.
4. Иванов К.К. // Успехи совр. биологии.– 1991– Т. III, вып.5.– С. 667–682.
5. Киричук В.Ф., Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В. и соавт. // Доклады IV Всесоюзного съезда патофизиологов.– Кишинев, 1989.
6. Киричук В.Ф., Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В. и соавт. //Физиологические механизмы развития экстремальных состояний: Материалы конф.– СПб., 1995. – С. 35–36.
7. Киричук В.Ф., Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Белов Л.Г.// Гомеостаз и инфекционный процесс: Материалы I Всерос. конф.– Саратов, 1996.– С. 219.
8. Клер К.И., Карен С.М., Алисон Д. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. –2000. – Т.2. – №1.– С. 4–16.
9. Мохин К.М.,Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В. //Принципы организации гематологической помощи: Тез. докл. конф. гематологов РСФСР 1987. – С. 213–214.
10. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология холеры. – Саратов, 1995. – 69 с.
11. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и лечение холеры. – Саратов: Изд–во Сарат. ун–та, 1988. – 272 с.
12. Понукалина Е.В. // Биоантиоксидант: Материалы международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья». – Тюмень, 1997. – С. 28.
13. Понукалина Е.В., Киричук В.Ф. // Материалы Всерос. науч. конф. с международным участием. – СПб., 1999. – С. 11–12.
14. Понукалина Е.В., Чеснокова Н.П., Киричук В.Ф. // Тромбоз, гемостаз, реология.– 2001.– №7.
15. Понукалина Е.В., Чеснокова Н.П., Киричук В.Ф. и соавт. // Материалы науч.–практ. конф., посв. 100–летию образования противочумной службы России.– Саратов, 1997. – Т. 2.– С. 101–102.
16. Чеснокова Н.П., Афанасьева Г.А., Жевак Т.Н. и соавт. // Биоантиоксидант: Материалы V Междунар. конф., 1998.
17. Смирнова Н.И. // Мед. генетика, микробиол. и вирусол. –1999. – №4.–С. 3–10.
18. Cheng E., Cardenas–Freytag L., Clements J.D. // Vaccine. – 1999. – Vol. 18. – №1–2. – P. 38–49.
19. Foss D.L., Lilliox M.J., Murtaugh M.P. // Infect. Immun. – 1999. – Vol.67. – №10. – P. 5275–5281.
20. Foss D.L., Murtaugh M.P. // Adv. Vet. Med. – 1999. – №41. – P. 83–104.
21. Gorovara S., Sapru S., Ganguli N.K. // Biochim.,Biophys.Acta.– 1998.– Vol.1407.– №1.– P. 21–30.
22. Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Ponukalina E.V. et al. // Proc. International I Society for Pathophysiology., 1991. – P. 231.
23. Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Ponukalina E.V. // Journal of Thrombosis and Haemostasis.– Florence, Italy.– 1997.– P. 545.
24. Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Ponukalina E.V. et al. // 16 th International Congress On Thrombosis.– Portugal.– 2000.– Ref. 222.
25. Kirichuk V.F., Ponukalina E.V. //16 th International Congress On Thrombosis.– Portugal.– 2000.– Ref. 223.
26. Ponukalina E.V., Bogomolova N.V. // Haemostasis International Journal on Haemostasis and Thrombosis Research. – Antalia, Turkey.– 1998.– P. 493.
27. Ponukalina E.V., Chesnokova N.P., Kirichuk V.F. et al. // Journal of Thrombosis and Haemostasis.– Florence, Italy.– 1997.– P. 544.
28. Ponukalina E.V., Kirichuk V.F. // The Official Journal of the International Society for Pathophysiology.– Finland, 1998.– Vol. 5.– P. 20.
29. Ponukalina E.V., Kirichuk V.F., Chesnokova N.P. et al. // Journal of the International Society on Thrombosis and Haemostasis.– 1995.– Vol. 73. –№6.