Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Попков В. М., Чеснокова Н. П., Ледванов М. Ю.,
4.2.2. Молекулярно-клеточные механизмы цитопатогенного действия токсинов Y.pestis и индукции шокового синдрома при чумной инфекции и интоксикации
Особенности структуры и биологических эффектов токсинов возбудителя чумы
Наличие природных очагов чумы, занимающих значительные территории, в том числе и в России, усиление международной и внутренней миграции населения, военные конфликты, а также возможность использования биотеррористами возбудителя в рецептуре биологических агентов создают неустойчивую эпидемиологическую обстановку и не только потенциальную, но и реальную угрозу возникновения вспышек чумы среди населения [2, 3, 34, 35, 70, 73].
В настоящее время достигнуты большие успехи в разработке профилактических мероприятий с использованием различных методов вакцинации, а также методов этиотропного лечения чумной инфекции, основанных на использовании антибиотиков широкого спектра действия, сульфаниламидных, нитрофурановых препаратов и т.д. [2, 47]. Использование высокоэффективных бактерицидных препаратов освобождает организм от возбудителя, однако сопровождается интенсивным распадом микробных клеток и выделением в системный кровоток разнообразных токсических и ферментных факторов патогенности возбудителя, в том числе эндотоксина. Персистирование токсинов в организме сопровождается сорбцией их структурами различных органов и тканей, развитием сенсибилизации, вторичных иммунопатологических и метаболических нарушений, во многом определяющих тяжесть течения и исход заболевания. Значимость указанных вторичных расстройств, отсутствие высокоэффективных методов их медикаментозной коррекции обусловливают необходимость дальнейшего изучения проблем патогенеза чумы, выявления общих закономерностей и особенностей эффектов токсинов и ферментов возбудителя и совершенствования принципов патогенетической терапии этого грозного заболевания.
Как известно, ведущая роль в патогенезе чумы и, в частности, эндотоксинового шока принадлежит эндотоксину Yersinia pestis [27]. Последний выделяется в основном при разрушении бактериальных клеток. Существует также свободный эндотоксин, продуцируемый бактериями в сравнительно небольшом количестве. O. Westphal и O. Luderitz (1952 г.) разработали водно-фенольный метод изолирования эндотоксина и провели свои классические исследования по биохимии эндотоксина. Полученный ими полимер состоял в основном из углеводов и жирных кислот. Важную роль в изучении ЛПС сыграли исследования, проведенные в Российском НИПЧИ «Микроб», где впервые в нашей стране был выделен эндотоксин чумного микроба и показано, что его фармакобиологическая активность типична для ЛПС – грамотрицательных бактерий.
Следует отметить, что патогенные эффекты эндотоксина Y. pestis потенцируются и модифицируются за счет экзотоксина, а также ферментов патогенности [48, 49].
Наряду с вышеуказанными общими закономерностями молекулярно-клеточной организации ЛПС многих представителей грамотрицательных бактерий, установлены определенные особенности нативного ЛПС чумного микроба.
В ряде отечественных и зарубежных работ опубликованы результаты всестороннего анализа структуры ЛПС, синтезируемых разными штаммами Y.pestis, отличающимися по географическому происхождению, эпидемической значимости, условиям культивирования: bv.medievalis ssp.pestis, bv.orientalis ssp.pestis, bv.antique ssp.pestis, bv.antique ssp.caucasica, bv.medievalis ssp.altaica и др.
ЛПС Y.pestis относится к R-форме молекул и не содержит полисахаридной цепи. Основными структурными единицами ЛПС чумного микроба являются кор и липид А. Внутренний кор образован 3-дезокси-?-D-манно-октулозовой кислотой, представленной двумя остатками L-глицеро-?-D-манно-гептозного трисахарида [24]. Липофильная часть молекулы ЛПС Y. pestis представлена липидом А, который был впервые описан в качестве нерастворимого в воде осадка, полученного при кислотной деградации молекулы ЛПС. Свободный липид А Y. pestis может быть получен только в результате мягкого кислотного гидролиза ЛПС, поскольку кетозидная связь между коровым олигосахаридом и липидом А является одной из наиболее кислотостабильных связей.
Как оказалось, в организме хозяина в условиях лизиса бактериальных клеток ЛПС образует комплексы с белковыми молекулами, в частности, с «мышиным» токсином, обладающим избирательной токсичностью в отношении мышей и крыс. В экспериментах с модифицированными формами ЛПС (ЛПС-28) выяснено, что при образовании физико-химических связей между «мышиным» токсином и коровой частью ЛПС изменяется конформация последней, что сопровождается преобразованием токсически неактивной формы ЛПС в чрезвычайно токсичную. В то же время различия в физико-химических и иммунобиологических свойствах ЛПС-28 и ЛПС-37 чумного микроба позволяют предположить, что их комплексы с «мышиным» токсином будут отличаться друг от друга по составу и токсичности.
К числу основных биологических свойств ЛПС чумного микроба относится способность вызывать местный и генерализованный феномен Шварцмана, активировать продукцию белков острой фазы воспаления, летальную активность, пирогенность, иммуногенность, митогенность, индуцировать освобождение фагоцитирующими клетками лизосомальных ферментов, цитокинов, токсических радикалов, стимулировать альтернативный путь активации комплемента, влиять на коагуляционный потенциал крови. Широкий спектр биологических эффектов ЛПС Y. pestis обусловлен гетерогенностью структуры рецепторов биологических мембран клеток различной морфофункциональной организации [12, 14, 16, 17].
Эндотоксин, попадая в кровоток, связывается с LBP–белком плазмы крови (lipopolysaccharid binding protein), относящимся к категории острофазовых белков. В комплексе с LBP-белком ЛПС транспортируется от мицеллярных агрегатов к мембранам и взаимодействует с CD14-рецепторами на поверхности клеток, в частности лейкоцитов, что ведет к активации клеточных функций, обеспечивающих фагоцитоз, представление антигенов, продукции NO, активных форм кислорода, низкомолекулярных медиаторов воспаления и группы провоспалительных цитокинов с полимодальными эффектами локального и системного действии, к которым относятся IL-1, IL-2, IL-6, IL-18, TNF, интерфероны I типа, хемокины и другие индукции цитокинобразования.
Однако катионные антимембраннные пептиды (КАМП) – факторы неспецифической защиты клеток различных тканей – имеют более высокое сродство к ЛПС по сравнению с сывороточным LBP–белком и таким образом препятствуют связыванию ЛПС с TLR. Y. рestis обладает способностью противостоять КАМП, причем на уровень устойчивости к ним влияет температура культивирования бактерий.
Методом проточной цитофлоуриметрии установлена способность ЛПС чумного микроба вызывать характерную для апоптоза деградацию ДНК лимфоцитов и перитонеальных макрофагов белых мышей in vitro, с учетом, что макрофаги более чувствительны к ЛПС, чем лимфоциты. Способность ЛПС чумного микроба индуцировать апоптоз макрофагов и лимфоцитов является дозозависимой.
Следует отметить, что эндотоксин чумного микроба оказывает выраженное патогенное действие на систему мононуклеарных фагоцитов, угнетая их поглотительную и секреторную активность. При этом наблюдаются изменения размеров и формы макрофагов, увеличивается объем цитоплазмы, появляются многочисленные вакуоли. Внутри фагоцитов ЛПС способен нейтрализовать действие катионных белков [1].
Сравнительный анализ влияния препаратов ЛПС на первичную культуру перитонеальных макрофагов экспериментальных животных показал, что метод выделения ЛПС и температура выращивания бактерий не оказывают существенного влияния на цитотоксичность препаратов.
Г.И. Васильева и соавт. отмечают более высокий дозозависимый эффект липополисахаридных препаратов в отношении макрофагов мышей, чем морских свинок, который обусловлен, по–видимому, большей чувствительностью макрофагов мышей к цитотоксическому действию ЛПС [24].
В соответствии с данными А.М. Дмитровского и Т.И. Тугамбаева (1986), после внутрибрюшинной инъекции ЛПС чумного микроба мышам выделяются три фазы изменения степени активности кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов: первая фаза – резкого угнетения, вторая – стимуляции и третья – стадия постепенного возврата активности к исходному уровню. При активации эндотоксином нейтрофилов и последующей их дегрануляции выделяется ряд биологически активных веществ, обусловливающих развитие инфекционно–токсического шока [28].
В ряде работ показано, что структура ЛПС определяет чувствительность микробных клеток к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов (КАМП) и других факторов неспецифической резистентности сыворотки крови, участвуя в связывании С3-фракции системы комплемента с поверхностью бактериальной клетки Y. pestis. Несмотря на то, что многие штаммы (за исключением штамма КIMD1, содержащего плазмиду pPst) способны фиксировать этот компонент комплемента, тем не менее, лизис микробных клеток под действием сыворотки возникает только при действии глубокого R– мутанта EV11M (ssp. pestis) и штаммов 1146 и 1680 р (ssp. caucasica). При этом лизис бактерий обеспечивается активацией комплемента по альтернативному пути.
Эндотоксин, взаимодействуя с рецепторами практически всех клеток крови и эндотелия сосудов, обеспечивает нарушение баланса различных биорегуляторных молекул, в частности, простагландинов [58]. Установлено, что ЛПС чумного микроба, как и другие бактериальные ЛПС, активирует циклоксигеназный и липоксигеназный пути метаболизма ненасыщенных жирных кислот. Изменения содержания простагландинов под влиянием ЛПС обусловливают развитие процессов тромбообразования, внутрисосудистой коагуляции, вазо- и бронходилятацию [39, 58].
Прямые и цитокинопосредованные патогенные эффекты эндотоксина Y.pestis на клетки различной морфофункциональной организации сопровождаются выраженными сдвигами интегративной деятельности прокоагулянтной, антикоагулянтной и фибринолитической систем с последующими расстройствами гемостаза, в том числе инициацией ДВС-синдрома и соответствующими нарушениями системной, регионарной гемодинамики и микроциркуляции. Так, гиперкоагуляционные сдвиги, обнаруженные Е.В. Понукалиной (1990) на начальных этапах развития чумной интоксикации, были обусловлены активацией внешнего механизма формирования протромбиназной активности за счет контактной активации XII фактора Хагемана [41].
В работах А.В. Захарова (1991 г.) показано, что введение живой чумной вакцины в дозах, не превышающих 100 млн микробных клеток, вызывает развитие однотипной компенсированной гиперкоагуляции, усиливающейся на пятые и седьмые сутки с нормализацией гемостатического потенциала крови к тридцатому дню после вакцинации.
Как известно, геморрагический синдром является одним из ведущих при чумной инфекции и интоксикации, осложняя течение всех клинических форм чумы, определяя тяжесть указанной патологии, отсутствие эффекта антибактериальной терапии, а зачастую, и развитие летальных исходов.
Характерной особенностью эндотоксемии является активация протеолитических систем, в частности, фибринолитической, которая опосредуется за счет калликреин-кининовой системы, системы комплемента, снижения концентрации ингибиторов и нарастание активности активаторов фибринолиза [41].
В исследованиях Е.В. Понукалиной (1990 г.) выявлены стабильная активация антикоагулянтных механизмов гемостаза и системы фибринолиза, сочетающиеся с развитием выраженного геморрагического синдрома [41].
Так, подкожное введение белым мышам ЛПС Y. pestis, а также гигадоз живой чумной вакцины (до 10 млрд. микробных клеток), ее аутолизата, и антигена, приготовленного по методу Буавена, сопровождаются развитием острого диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и усилением фибринолиза. ЛПС, живая чумная вакцина штамма ЕВ и ее аутолизат вызывают существенное снижение активности фактора XIII – фибриназы.
Не вызывает сомнения тот факт, что ЛПС чумного микроба оказывает выраженное цитопатогенное воздействие на эндотелий сосудов, рецептируется форменными элементами периферической крови, а также клетками различных органов и тканей, оказывая прямое и цитокинопосредованное полимодальное действие на состояние активности прокоагулянтной, антикоагулянтной, фибринолитической систем, а также механизмов тромбоцитарно-сосудистого звена системы гемостаза, индуцируя активацию классического и альтернативного механизмов формирования протромбиназной активности с последующим развитием гипоагуляции «потребления». Вместе с тем, сведения о состоянии свертывающей и антикоагулянтной систем крови, патогенезе геморрагического синдрома при чумной инфекции и интоксикации единичны, не носят систематизированного характера.
До настоящего времени остается практически неизученным состояние реологических свойств крови как при чумной инфекции и интоксикации, так и при действии основных токсических и антигенных фракций чумного микроба.
Принимая во внимание приведенные выше данные литературы относительно биологических эффектов ЛПС чумного микроба, проявляющиеся выраженными сдвигами интегративной деятельности прокоагулянтной, антикоагулянтной и фибринолитической систем с последующими расстройствами гемостаза, изменением функций эндотелия, клеток периферической крови, представляется целесообразным дополнить существующие концепции механизмов нарушений реологических свойств крови при чумной интоксикации.
В связи с этим в экспериментах с использованием внутрибрюшинного введения белым крысам ЛПС чумного микроба нами изучены вязкость цельной крови, сыворотки, плазмы при различных скоростях сдвига, а также индексы деформируемости и агрегации эритроцитов, показатели гематокрита. В различных вариантах моделирования чумной интоксикации с использованием ЛПС в возрастающих дозах (от ЛД25 до 2ЛД50), выявлена общая закономерность снижения реологических свойств крови, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов при различных скоростях сдвига, коррелирующая с тяжестью течения изучаемой патологии.
Полученные нами результаты позволяют заключить, что к числу ведущих патогенетических факторов расстройств регионарного кровотока и микроциркуляции при чумной интоксикации, индуцируемой ЛПС Y. pestis, относится снижение реологических свойств крови при различных скоростях сдвига, индексов деформируемости и агрегации эритроцитов, коррелирующее с тяжестью клинических проявлений патологии.
На основании этих результатов можно сделать вывод, что уменьшение вязкости цельной крови при малых скоростях сдвига в значительной мере обусловливается развитием системного воспалительного ответа и резким возрастанием в крови уровня острофазных высокомолекулярных белковых и липопротеидных фракций, опосредующих межклеточные взаимодействия. Возрастание вязкости крови при малых скоростях сдвига вызвано резким увеличением гематокритного показателя. Возрастание индексов деформируемости и агрегации эритроцитов, а также вязкости крови при высоких скоростях сдвига связаны, возможно, с изменением структуры мембраны эритроцитов под влиянием ЛПС чумного микроба [7–12, 14–16].
В последние годы в качестве одного из интегративных показателей тяжести аутоинтоксикации при патологии инфекционной и неинфекционной природы используют определение в крови так называемых средних молекул – веществ молекулярной массой от 500 до 5000, накапливающихся в крови при интоксикациях. Как известно, из пула молекул средней массы выделены олигопептиды с высоким содержанием дикарбоновых аминокислот, цистеина, лизина, глицина и низким содержанием ароматических аминокислот, а также углеводные компоненты, соединения глюкуроновой кислоты и олигосахара. Некоторые из этих веществ являются продуктами деградации сывороточных белков, в частности ?-цепи фибриногена и ?2-цепи-микроглобулина. Установлено, что группа веществ средней молекулярной массы включает в себя и продукты липопероксидации. В последующем нами проведены сравнительные серии экспериментов на белых крысах по изучению эффектов ЛПС чумного микроба на интенсивность процессов ПОЛ и уровень молекул средней массы. Как оказалось, воздействие ЛПС сопровождалось прогрессирующим накоплением продуктов липопероксидации в плазме крови и эритроцитах экспериментальных животных, что закономерно сочеталось с накоплением средних молекул в крови. Интенсификация процессов ПОЛ и повышение уровня средних молекул коррелировали с нарастанием тяжести симптомов интоксикации [4, 5, 6].
Одно из первых мест по значимости в патогенезе чумной инфекции и интоксикации занимает «мышиный» токсин [1, 37].
В 1952 г. Е.E.Baker и соавторы выделили фракцию токсина, способную в незначительных дозах (0,1–3 мкг) убивать мышей и крыс через короткий промежуток времени (6–10 часов), однако являющуюся безвредной для кроликов, морских свинок и собак. Так, введение морским свинкам этой фракции токсина в дозах более 1000 мкг не приводит к гибели животных. Учитывая особенности чувствительности животных, белковая субстанция и была названа «мышиным» токсином.
По данным E.Е. Baker и соавт. (1952), токсин чумного микроба входит в состав водорастворимых компонентов клетки, представляющих собой её поверхностные «оболочечные» антигены. Из водного экстракта клеток токсин может быть осажден при действии 55–67 %-го раствора сульфата аммония («фракция II» или FII).
«Мышиный» токсин является белком, входящим в состав цитоплазматической мембраны микробной клетки, и извлекается после дезинтеграции чумных бактерий ультразвуком. Установлено, что синтез видоспецифического «мышиного» токсина чумного микроба детерминируется генами, расположенными на плазмиде рМТ1. Некоторые авторы связывают генетический контроль синтеза токсина с плазмидой pFra, молекулярная масса которой лежит в пределах 61–65 мДа [1].
Очищенный «мышиный» токсин представляет собой совокупность двух субъединиц: А и В, которые являются легко инактивирующимися термолабильными белками, устойчивыми к действию трипсина и 0,05–0,1 %-го раствора додецилсульфата натрия [72]. Белок А связан с мембраной клетки и имеет молекулярную массу 240 кДа. Субъединица В обнаруживается в цитоплазме возбудителя, имеет молекулярную массу 120 кДа. Белки отличаются по аминокислотному составу: так, субъединица В содержит 7 остатков триптофана, а субъединица А – 20. Оба белка характеризуются высоким содержанием дикарбоновых аминокислот и низким содержанием цистеина. Аминокислотный состав важен для сохранения токсичности, так удельная токсическая активность субъединицы А выше, чем таковая субъединицы В. При оценке аминокислотного состава «мышиного» токсина в целом на содержание тирозина, серина, триптофана, которые могут быть участками обратимого фосфорилирования, оказалось, что содержание данных аминокислот – 5,3; 7,7; 4,3 % соответственно.
В результате компьютерного анализа первичной структуры «мышиного» токсина обнаружены три потенциальных сайта N-гликозилирования. Цистеин-11 отдален от цистеина-187 тремя последовательно расположенными сайтами гликозилирования, что не исключает возможности образования одной внутримолекулярной S–S–связи. Анализ вторичной структуры «мышиного» токсина показал чередование двенадцати участков альфа–спирали и 8–9 областей типа бета-складчатого листа. Обнаружено 23 потенциальных бета-поворота полипептидной цепи. Шесть бета-структур несут гидрофобные участки, а одна наделена амфипатическими признаками. В составе «мышиного» токсина выявлены 74 амфипатические аминокислоты, могущие иметь значение для формирования стабильных структур, в которых гидрофильные и гидрофобные радикалы располагаются на противоположных поверхностях [37, 38].
При действии 0,5–1 %-го раствора додецилсульфата натрия белки А и В диссоциируют на олигомеры, сохраняющие токсичность, с молекулярной массой 24 кДа и одной дисульфидной связью. Полагают, что субъединица А состоит из 10 олигомеров, а В – из 5. Каждый олигомер после разрыва дисульфидной связи распадается на два полипептида с молекулярной массой 12 кДа. Считается, что только один из этих полимеров является общим у белков А и В. В нативной форме «мышиный» токсин, по–видимому, представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 61 кДа каждая. Предполагается, что участок полипептидной цепи токсического белка, ответственный за фиксацию его на клеточном рецепторе, локализован в субъединице с молекулярной массой 12 кДа, а токсофорный центр – в той зоне олигомера, которая находится около дисульфидной связи и включает остаток триптофана [55].
«Мышиный» токсин чумного микроба является полифункциональной биомолекулой и обладает разнообразной ферментативной активностью: киназной, фосфатазной, фосфодиэстеразной, фосфолипазной, амилазной, NAD–гликогидролазной, существенных для проявления его летальных свойств. Так, «мышиный» токсин способен гидролизовать АТФ и ГТФ. У токсина отмечена фосфатазная активность в отношении 3,5-цАМФ, 2,3 цАМФ, что позволяет предположить наличие активности фосфодиэстеразы цАМФ. Установлено, что «мышиный» токсин обладает аутофосфорилирующей и дефосфорилирующей активностью [37]. Феномен аутофосфорилирования «мышиного» токсина заключается в возможности фосфорилирования остатков треонина собственной молекулы. Кроме того, токсин обладает аутокиназной, дезаминазной, NAD–гликогидролазной активностью. Дестабилизация биологических мембран при интоксикации «мышиным» токсином связана с наличием у него активности фосфолипазы D. Установлено, что благодаря этому он действует на фосфатидилхолин, разрушает фосфолипидный компонент мембран эритроцитов, а также подавляет активность их Nа+, К+–АТФ-азы.
«Мышиный» токсин обладает способностью ингибировать тканевое дыхание за счет блокады цепи переноса электронов на уровне коэнзима Q, что обеспечивает развитие тканевой гипоксии. Как известно, гипоксия сопровождается активацией процессов анаэробного гликолиза, накоплением недоокисленных продуктов метаболизма и развитием метаболического ацидоза. В работах В.С. Каграманова и соавт. (2001 г.) показано, что у экспериментальных животных под влиянием «мышиного» токсина наблюдается развитие метаболического ацидоза [31].
Важным звеном в реализации биоэффектов чумного «мышиного» токсина является его способность влиять на межклеточные взаимодействия в иммунной системе и на выработку цитокинов. В литературе есть сведения о том, что «мышиный» токсин обладает IL-1-индуцирующей активностью, проявляющейся при воздействии очень низких доз токсина (0,01–0,1 мкг/мл). Воздействие более высоких доз (1,0 мкг/мл) сопровождалось меньшим эффектом. Кроме того, выявлено, что по способности индуцировать синтез IL-1 «мышиный» токсин превышает активность ЛПС E.coli. Изучение способности «мышиного» токсина индуцировать синтез TNF-? выявило, что таковая активность токсина носит дозозависимый характер. Максимальный уровень синтеза TNF-? отмечался при воздействии самой высокой использованной дозы (1,0 мкг/мл). Обнаружена также дозозависимая способность «мышиного» токсина индуцировать продукцию IL-2: максимальный эффект отмечали при воздействии самых низких доз токсина (0,01 мкг/мл). Представленные данные позволили авторам сделать вывод о том, что «мышиный» токсин обладает цитокининдуцирующей активностью, свойственной суперантигенам, благодаря чему вызывает поликлональную стимуляцию Т-лимфоцитов, являющихся основной мишенью его воздействия в макроорганизме. Летальный эффект «мышиного» токсина может быть опосредован гиперпродукцией цитокинов провоспалительного характера TNF-?, IL-1 и IL-2 [36, 37].
Однако, по данным Н.В. Емельяновой (1992) и других авторов, не было обнаружено достоверного увеличения продукции IL-1 под влиянием «мышиного» токсина как у мышей, иммунизированных вакцинным штаммом ЕV, так и у мышей, которые не были предварительно иммунизированы.
Рядом авторов было показано, что «мышиный» токсин в условиях in vitro и in vivo выступает в роли фактора, модифицирующего структуру и токсические свойства ЛПС. Этот факт подтверждается результатами дот–блот–анализа, позволившего обнаружить способность «мышиного» токсина образовывать комплексы с ЛПС Y. pestis, E. coli, S. typhosa, S. marcescens. Присутствующая в S-ЛПС О-антигенная цепь не препятствует образованию физико-химических связей с «мышиным» токсином. Исключение составил лишь ЛПС туляремийного микроба [49]. При образовании комплекса ЛПС с «мышиным» токсином изменяется его презентация LPB-белку, CD14-рецепторам моноцитов и макрофагов и передача трансмембранного сигнала через TLR2/TLR4. Между токсичностью комплексов ЛПС ? «мышиный» токсин и их способностью индуцировать синтез TNF-? выявлена обратная зависимость: усиление токсичности ЛПС28 и ЛПС37 под влиянием «мышиного» токсина не сопровождается увеличением синтеза TNF-?, а, наоборот, приводит к существенному его снижению. Причем закономерность, установленная на модели комплекса ЛПС-«мышиный» токсин Y. pestis, характерна для многих патогенных бактерий.
Вместе с тем клетками-мишенями для «мышиного» токсина являются макрофаги. Повреждение макрофагов в результате цитотоксического воздействия «мышиного» токсина лежит в основе нарушения антигенпредставляющих, иммуномодулирующих функций этих клеток и соответственно формирования иммунологических реакций. Возможно, одной из причин различной чувствительности мышей и морских свинок к «мышиному» токсину является разная устойчивость макрофагов этих животных к его цитотоксическому действию. Антимакрофагальный эффект токсина, по-видимому, является одним из механизмов участия «мышиного» токсина в патогенезе чумы [37].
В опытах in vitro «мышиный» токсин вызывает подавление пролиферации предактивированных Т-лимфоцитов за счет гибели клеток по механизму апоптоза [25].
Установлено также, что «мышиный» токсин обладает, подобно другим токсинам, в частности стафилококковому энтеротоксину, выраженным дозозависимым апоптогенным действием в отношении фагоцитов мышей, причем макрофаги подвержены этому действию сильнее, чем нейтрофилы.
Так, в экспериментах обнаружено, что с понижением дозы токсина до 0,01 мкг/мл увеличивалась доля клеток, погибших в результате апоптоза, и почти отсутствовал некротический тип повреждения и, наоборот, с повышением дозы «мышиного» токсина до 1,0 мкг/мл и выше возрастала доля фагоцитов, погибших в результате некроза, и уменьшалось число клеток, вступивших в апоптоз. Выявленные факты могут лежать в основе формирования иммунопатологических реакций, в частности развития апоптогенного иммунодефицита и, по-видимому, могут быть одним из возможных механизмов патогенетического действия «мышиного» токсина. Однако апоптогенное действие «мышиного» токсина не распространяется на фагоциты морских свинок.
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что клеточными мишенями «мышиного» токсина в организме могут быть тромбоциты и эндотелий сосудов. Введение «мышиного» токсина экспериментальным животным приводит к резко выраженной тромбоцитопении и изменению функциональных свойств кровяных пластинок.
Подобно любому белку, «мышиный» токсин обладает антигенными свойствами. Очищенный токсин, смешанный с адъювантом Фрейнда, вызывает у кроликов образование антитоксина, способного нейтрализовать токсин из вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба. Токсин сенсибилизирует тонизированные эритроциты, которые в реакции гемагглютинации могут служить для определения уровня антитоксина в крови, и связывает комплемент.
Очищенный токсин не вступает в реакцию с антикапсульными сыворотками, а антитоксин не реагирует с капсульным антигеном. Однако антитоксические сыворотки не предохраняют против чумы, а токсин нельзя превратить в настоящий анатоксин, хотя при соответствующей обработке он теряет токсичность и продолжает связываться со специфическими антителами.
От таких истинных экзотоксинов, как, например, дифтерийный или столбнячный, «мышиный» токсин отличается еще двумя признаками. Во-первых, при его введении нет латентного периода (при надлежащей дозе действие проявляется сразу же), а, во-вторых, отсутствует прямая связь между вирулентностью и токсичностью культур.
Кроме того, некоторые симптомы чумной интоксикации, вызванной введением «мышиного» токсина, очень сходны с симптомами интоксикации, вызываемой эндотоксинами. На основании сказанного ряд авторов считает, что «мышиный» токсин нельзя отнести к категории истинных экзотоксинов [30].
Известно, что «мышиный» токсин чумного микроба является конкурентным антагонистом ?-адренорецепторов на поверхности клеточных мембран. Связываясь с рецептором, токсический белок инактивирует аденилатциклазу и тем самым блокирует регуляцию внутриклеточных метаболических реакций, обеспечиваемую катехоламинами, глюкагоном и другими гормональными и гуморальными регуляторами. Так, блокада ?2-адренорецепторов плазматических мембран кровяных пластинок закономерно приводит к гиперагрегации тромбоцитов.
В изменении функции тромбоцитов и содержания в них циклических нуклеотидов выявляется определенная стадийность. Гиперагрегация, возникающая на ранних этапах интоксикации, сменяется гипоагрегацией на поздних, необратимых стадиях. Последнее обусловлено резким повышением уровня цГМФ в кровяных пластинках [56].
Чумной «мышиный» токсин ингибирует гормониндуцированное образование продуктов фосфоинозитидного обмена и простациклина. В результате повреждающего действия токсина на эндотелий сосудов резко уменьшается концентрация простациклина в плазме крови. Предполагают, что нарушения в системе гемостаза, возникающие при чумной интоксикации, особенно на ранних этапах, обусловлены эффектом «мышиного» токсина на кальциймобилизующую систему эндотелиальных клеток сосудов [59].
Анализируя приведенные выше данные в целом, следует заключить, что важная роль в механизмах развития геморрагического синдрома, доминирующего в клинике чумной инфекции и интоксикации, связана в значительной мере с цитопатогенными эффектами ЛПС и «мышиного» токсина Y. pestis на эндотелий сосудов, тромбоциты, макрофаги. Последние сопровождаются активацией классического и альтернативного путей формирования протромбиназной активности, активации тромбоцитарного звена гемостаза и системы фибринолиза с последующим развитием гипокоагуляции «потребления» и геморрагического синдрома.
В проведенных сравнительных сериях экспериментов на белых крысах в динамике чумной интоксикации, индуцируемой «мышиным» токсином, нами выявлен параллелизм нарушений вязкостных свойств цельной крови, сыворотки и плазмы, а также накопления продуктов липопероксидации, снижения деформируемости эритроцитов, появления жестких эритроцитов [13].
Полученные данные свидетельствуют о важной роли активации перекисного окисления липидов в дестабилизации эритроцитарных мембран, снижении их перекисной устойчивости, деформируемости и вязкостных свойств крови, обусловливающих нарушение процессов микроциркуляции, оксигенации и трофики тканей при чумной интоксикации.
Позднее нами проведены работы по установлению коррелятивной взаимосвязи состояния процессов липопероксидации и стабильности биологических мембран клеток крови как при сочетанном воздействии токсических и ферментных факторов патогенности, так и при воздействии отдельной фракции – «мышиного» токсина вакцинного штамма ЕВ чумного микроба [13, 48]. В динамике интоксикации, достигаемой введением экспериментальным животным «мышиного» токсина, обнаружено развитие прогрессирующих нарушений клеточного состава крови. Полученные данные свидетельствуют о возможности акцепции клетками периферической крови чумного «мышиного» токсина, важной роли его в активации процессов ПОЛ и дестабилизации биологических мембран клеток, закономерно сопровождающихся цитолизом эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов.
В сравнительных сериях экспериментов на белых крысах изучены эффекты F2 вакцинного штамма ЕВ чумного микроба – «мышиного» токсина – на интенсивность процессов ПОЛ и уровень молекул средней массы. Как оказалось, «мышиный» токсин обеспечивал выраженную активацию процессов липопероксидации в биологических мембранах, что сопровождалось прогрессирующим накоплением продуктов липопероксидации в плазме крови, эритроцитах экспериментальных животных и средних молекул в сыворотке крови [8].
Многочисленные литературные источники убедительно свидетельствует о том, что проблемы патогенеза чумной инфекции и молекулярно-клеточных механизмов развития биологических эффектов токсических и ферментных факторов патогенности возбудителя далеки от своего разрешения. Очевидно, что важная роль в механизмах индукции геморрагического синдрома, доминирующего в клинической картине чумы, должна быть отведена ЛПС, «мышиному» токсину, комплексу ферментов патогенности: фибринолизину, протеазе, гиалуронидазе, нейраминидазе, фосфолипазе и др. Однако вслед за селективной рецепцией токсинов возбудителя чумы возникают вторичные неспецифические метаболические и функциональные расстройства. Чумная инфекция, как и любой другой инфекционный процесс, на высоте развития представляет собой совокупность неспецифических типовых патологических процессов и реакций. К таковым относятся лихорадка, воспаление, синдром системного воспалительного ответа, нарушения вводно-электролитного и кислотно-основного баланса, общий адаптационный синдром и другие.
Обращает на себя внимание тот факт, что чумная инфекция и интоксикация сопровождаются развитием выраженной гипоксии сложного генеза, включающего в себя циркуляторные, гемические, дыхательные, тканевые расстройства.
Следует отметить, что в основе развития циркуляторных расстройств при чумной инфекции и интоксикации лежит, по-видимому, сложный комплекс патогенетических механизмов. Так, очевиден прямой миокардиотоксический эффект факторов патогенности чумного микроба, клиническими признаками которого являются расширение границ сердца, глухость сердечных тонов, аритмия, прогрессирующая тахикардия, резкое падение артериального давления и т.д.
С другой стороны, не исключена возможность прямого цитопатогенного воздействия токсических и ферментных факторов патогенности возбудителя на сосуды. Известно, что нейраминидаза, гиалуронидаза, фосфолипаза, протеазы чумного микроба воздействуют на компоненты межклеточного вещества, биологических мембран, такие как гиалуроновая кислота и продукты ее деградации, гликопротеиды, гликолипиды, олигосахариды, аминокислоты и пептиды, фосфолипиды и др. [29, 48].
Выраженный патогенный эффект на сосуды могут оказывать «мышиный» токсин и эндотоксин липополисахаридной природы.
Как известно, в динамике чумной инфекции и интоксикации возникает не только циркуляторная, но и гемическая гипоксия, обусловленная способностью различных фракций гемолизина, аденилатциклазы и цАМФ-связывающего белка чумного микроба вызывать дезорганизацию мембран эритроцитов [22]. Известны также неспецифические гемолизины – аммиак и другие летучие амины, обеспечивающие интенсивный распад эритроцитов. Таким образом, продукция гемолизинов и других факторов патогенности чумного микроба является одной из важных причин развития гемической гипоксии при чумной инфекции и интоксикации.
В литературе есть указания на развитие тяжелой тканевой гипоксии в процессе развития указанной инфекционной патологии. Так, под влиянием «мышиного» токсина и основного соматического антигена чумного микроба происходят набухание митохондрий и нарушение сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования, транспорта электронов в ферментной цепи за счет торможения энзиматической активности дегидрогеназ [23].
В основе развития тяжелой гипоксии, свойственной различным клиническим формам чумной инфекции, может быть и дыхательная недостаточность, обусловленная развитием первичной и вторичной пневмонии, нарушением кровообращения в легочной ткани, отеком легких, а также возникновением периодического дыхания [46, 47].
Расстройства микрогемодинамики, регионарного и системного кровотоков могут быть обусловлены также нарушениями коагуляционного потенциала крови, ее реологических свойств.
Общей закономерностью гипоксических состояний различного происхождения, в том числе возникающих в динамике чумной инфекции и интоксикации, являются формирование метаболического ацидоза за счет избыточного накопления в крови и тканях продуктов гликолиза, протеолиза, липолиза, нарушение электролитного баланса клеток, а также активация процессов свободнорадикального окисления липидов, вызывающих дестабилизацию биологических мембран клеток различных органов и тканей, нарушение их возбудимости и функциональной активности [23, 31, 62].
Данные многочисленных экспериментальных и клинических исследований, направленных на выяснение роли свободнорадикального окисления липидов в патогенезе разнообразных патологических процессов и заболеваний, позволяют рассматривать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) как универсальный механизм повреждения мембранных структур клеток различных органов и тканей при воздействии патогенных факторов инфекционной и неинфекционной природы [18, 26, 33, 42, 53].
Таким образом, в условиях бактериально–токсического шока при чумной инфекции и интоксикации возникает сложный комплекс вторичных неспецифических метаболических и функциональных расстройств, заметно усугубляющих тяжесть течения заболевания и нередко являющихся причиной отсутствия должного эффекта терапевтических мероприятий.
В связи с этим не подлежит сомнению актуальность дальнейших исследований взаимосвязи и значимости специфических эффектов токсических и ферментных факторов патогенности чумного микроба и вторичных неспецифических нарушений метаболических процессов и функций различных органов и систем в патогенезе чумной инфекции и интоксикации. Использование в целях депотенцирования цитопатогенного и летального действий токсических компонентов возбудителя чумы антиоксидантов, антигипоксантов, мембранопротекторов, донаторов сульфгидрильных групп может в значительной мере повысить эффективность комплексного лечения указанной патологии, расширить возможности объективной оценки тяжести заболевания, прогнозирования его развития.