Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

АКТИВАЦИЯ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ КАК ВЕДУЩИЙ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ФАКТОР РАЗВИТИЯ ТИПОВЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И ЗАБОЛЕВАНИЙ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ

Попков В. М., Чеснокова Н. П., Ледванов М. Ю.,

4.6. О роли активизации процессов липопероксидации в патогенезе инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы В.В. Моррисон, В.И. Кузнецов

Среди инфекционных заболеваний значительный удельный вес приходится на геморрагическую лихорадку с почечным синдромом, гемоконтактные вирусные гепатиты, дифтерийную инфекцию.

Актуальность ГЛПС связана с её широким распространением на Евроазиатском континенте, при этом определенный уровень заболеваемости поддерживается формированием природных очагов инфекции [9, 45].

Наличие в патогенезе болезни вирусемии, массивной вазопатии, запуск иммунокомплексных реакций, нарушений микроциркуляции, системы гемостаза, возникающие органные поражения, особенно развитие острой почечной недостаточности, зачастую сопровождаются декомпенсированными сдвигами показателей гомеостаза, определяющими тяжесть течения болезни и ее исход.

Среди гемоконтактных вирусных гепатитов острый гепатит В имеет широкое распространение, обеспечивая тем самым высокий уровень заболеваемости во многих регионах страны.

Находясь в организме человека или сочетая своё присутствие с другими гепатотропными вирусами, вирус В может приводить к развитию наиболее тяжелых и хронических форм инфекции с формированием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы.

Вирус В, обладая слабым цитопатическим действием, запускает каскад иммунопатологических и опосредованных реакций, вызывающих цитолиз гепатоцитов, который определяет патоморфологические изменения печени, тяжесть течения инфекционного процесса.

Дифтерийная инфекция, несмотря на тенденцию к снижению уровня заболеваемости, продолжает привлекать внимание исследователей, особенно в плане решения клинико-патогенетических, эпидемиологических, профилактических проблем.

Отмечается тот факт, что при снижении количества больных дифтерией ротоглотки произошло увеличение случаев тяжелых форм инфекции.

В механизме развития данной патологии развертываются типовые реакции этапного воздействия на органы, ткани, системы организма с формированием прямого цитопатогенного эффекта дифтерийного токсина и опосредованного действия реактогенных метаболитов, иммунопатологических процессов, приводящих к формированию поражения миокарда, периферической нервной системы, нарушений гемостаза, микроциркуляции .

Период разгара изучаемых инфекций: ГЛПС, острого гепатита В, дифтерии ротоглотки сопровождается поражением органов и систем организма с развитием выраженного интоксикационного синдрома, основанного на интенсификации катаболических или анаболических, энергетических процессов, что является реакцией организма на отклонения в системе гомеостаза и служит маркёром адекватности адаптационных реакций, отражающихся в показателях биохимического статуса.

Накопление в плазме метаболитов: аминокислот, жирных кислот, лактата, промежуточных продуктов обмена, медиаторов воспаления, измененных метаболитов, потенцирует патологические эффекты в условиях интоксикации, усиливая формирующуюся патологию [18]. При этом в организме может создаваться стрессовая ситуация, сопровождающаяся переключением углеводного обмена на липидный, изменением гормонального фона с активацией фосфолипаз, развитием ферментемии, протеолиза, липолиза, интенсификацией перекисного окисления липидов [7, 27), которая может реализовываться развитием некроза, усилением апоптоза клеток, причём основным отличием второго от первого следует считать структурную сохранность цитоплазматических и органоидных мембран [28].

Развитие тяжелых форм инфекционных заболеваний, как правило, сопровождается гипоксическим синдромом сложного генеза. При этом, в условиях гипоксии возникает индукция образования избыточных концентраций свободных радикалов и активных форм кислорода [38].

Свободнорадикальное окисление является одним из универсальных механизмов повреждения клеток, но вместе с тем это необходимый для нормального функционирования клеток процесс. Состояние процессов липопероксидации в условиях нормы определяет характер модификаций фосфолипидного бислоя биомембран, энергетического и пластического обеспечения клеток, активность транспортных и рецепторных мембранных систем, возбудимость клетки и многие внутриклеточные метаболические процессы [6, 8, 37].

В то же время интенсификация свободнорадикального окисления является типовым процессом дезинтеграции биомембран при различных формах патологии инфекционной и неинфекционной природы [2, 14, 30].

Несмотря на очевидную возможность активации процессов свободнорадикального окисления, модификации структурных компонентов биомембран при инфекционной патологии, в частности при ГЛПС, остром гепатите В, дифтерии ротоглотки, до настоящего момента остается малоизученным вопрос о роли активации процессов свободнорадикального окисления, степени изменения показателей липидного обмена в острой фазе и реконвалесценции вышеобозначенных заболеваний.

Изложенное выше определило цель работы: установить значение показателей плазменных и мембранных липидов, интенсивности свободнорадикального окисления в патогенезе ГЛПС, острого гепатита В, дифтерии ротоглотки и определить возможность применения полученных результатов в диагностике тяжести течения болезней, оценке полноты выздоровления, прогнозирования развития осложнений, затяжного течения инфекционного процесса, рациональной коррекции выявленных нарушений.

Одной из задач исследования являлось создание модели регистрации интенсивности свободнорадикальных процессов в биопробах. Для этого был применен метод регистрации сверхслабых свечений, основанный на работах многих авторов [12, 31]. Измерение хемилюминесценции проводили на аппарате ХЛМ 1 ц – 01, используя для работы плазму, эритроциты, эритроцитарные мембраны, что позволяло косвенно судить об интенсивности свободнорадикального окисления в клеточном, межклеточном секторах и в биомембранах.

Применение нескольких индукторов свечения, таких как перекись водорода, двухвалентное железо и ультрафиолетовое облучение, позволяло нивелировать результаты индуцированного свечения, связанные с возможным наличием в пробах свободного гемоглобина, избытка металлов переменной валентности [13].

Исследование показателей липидного обмена, с выделением эритроцитов и эритроцитарных мембран, с определением общих липидов в плазме крови, общих фосфолипидов и их спектра в плазме и эритроцитах, осуществлялось по общепринятым методикам, включая метод тонкослойной хроматографии [17].

Для реализации поставленной цели и выполнения задач исследования были обследованы 49 больных дифтерией ротоглотки, 50 больных острым гепатитом В, 158 больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом и 20 практически здоровых лиц в качестве контрольной группы.

При изучении показателей липидного обмена и свободнорадикального окисления при дифтерии ротоглотки были выделены группы больных с локализованной, распространенной, субтоксической, токсическими I, II, III степени формами болезни.

Исследование биопроб при локализованной и распространенной формах проводились при поступлении больных в стационар (1-е сутки лечения), на 3–4-е и 6–8-е сутки лечения. При субтоксической и токсических формах дифтерии ротоглотки проводилось дополнительное обследование на 4-й неделе лечения (20–25-е сутки пребывания в стационаре). Диагностика болезни производилась в соответствии с «Единой рабочей классификацией клинических форм дифтерии».

Проведенные исследования показали, что при локализованной форме дифтерии максимальное усиление интенсивности свободнорадикального окисления в различных средах организма, с истощением уровня антиоксидантной защиты, зафиксировано только в первые сутки пребывания больных в стационаре. Данные сдвиги сопровождались изменением содержания сфингомиелина биомембран, указывающим на тенденцию к увеличению трудноокисляемых фракций структурных фосфолипидов. Отсутствие сдвигов в состоянии плазменных липидов свидетельствовало о минимальной интенсивности метаболических процессов, результатом которой являлась полная компенсация в образовании, перераспределении, утилизации липидов с незначительным изменением мембрано – рецепторного комплекса, чему соответствовала форма болезни и умеренность выраженности интоксикационного синдрома.

Применение различных индукторов свечения при локализованной форме болезни в целом подтверждало информацию об интенсивности процессов СРО, выявляемую спонтанной ХЛ, однако при нормализации этого показателя перекись водорода обнаруживала повышенную способность к окислению в эритроцитах до 6–8 суток лечения, двухвалентное железо проявляло повышенную способность к окислению в плазме и эритроцитах только в 1-е сутки лечения, причем одновременно с изменением спонтанной ХЛ, но при этом в мембранах во все сроки наблюдения повышенной способности к окислению не определяло. Ультрафиолетовое облучение не выявляло повышения окисления в мембранах, но в плазме и эритроцитах повышенную способность к окислению обнаруживало до 6–8-е суток лечения включительно.

При распространенной форме дифтерии проведенный анализ выявлял в плазме, эритроцитах, мембранах максимальный уровень активации свободнорадикальных реакций в первые сутки лечения в стационаре, но в отличие от данных локализованной формы болезни, процессы СРО в средах организма оставались в повышенно – интенсивном состоянии на 3–4-е сутки лечения. Отсутствие изменений плазменных липидов косвенно свидетельствовало о равноценной интенсивности метаболических процессов у больных локализованной и распространенной форм дифтерии, но увеличение содержания в мембранных фосфолипидах лизофосфатидилхолина, сфингомиелина, фосфатидной кислоты прямо указывало на большую степень конформационных сдвигов в биомембранах при распространенной форме болезни.

Применение перекиси водорода у данной группы больных обнаруживало повышенную способность к окислению в плазме и мембранах на 3–4-е сутки, а в эритроцитах на 6–8-е сутки лечения. Двухвалентное железо аналогичные процессы определяло в мембранах на 1 сутки, в плазме и эритроцитах на 3–4-е сутки лечения. Ультрафиолетовое облучение выявляло повышенную способность к окислению в плазме и эритроцитах на 6–8-е сутки, в мембранах на 3–4-е сутки лечения больных с распространенной формой дифтерии.

При токсических формах дифтерии ротоглотки наличие повышенной активности процессов СРО регистрировали во всех средах организма практически до 20–25 суток от начала лечения, причем максимальная выраженность свободнорадикального окисления приходилась на 1 сутки и 3–4-е сутки лечения, что составляло принципиальное отличие от результатов больных с локализованной и распространенной формами дифтерии.

Применение индукторов свечения в целом подтверждало повышенную интенсивность процессов СРО в средах организма больных токсическими формами болезни, в то же время давала разную информацию по оценке способности к окислению исследуемых субстратов, определяющую соотношение прооксидантной и антиоксидантной систем.

Индукция хемилюминесценции перекисью водорода биопроб больных данных групп в различной степени указывала на повышенную способность к окислению плазмы, эритроцитов, мембран во все сроки обследования, включая 20–25 сутки с момента госпитализации. Индукция свечения двухвалентным железом определяла повышенную способность к окислению в плазме на 20–25 сутки лечения при всех токсических фор мах дифтерии, при этом в эритроцитах повышенная способность к окислению при субтоксической и токсической II степени формах определялась до 6–8 суток от начала лечения, а при токсических I и III степени формах до 20–25 суток лечения. В эритроцитарных мембранах применение железа обнаруживало повышение способности к окислению при субтоксической форме на 3–4 сутки лечения, при токсических I и II степени формах на 6–8 сутки, при токсической III степени форме болезни на 20–25 сутки.

Важной особенностью индуцированной ХЛ двухвалентным железом являлся эффект гашения свечения в плазме в периоде разгара при токсических формах болезни. Наличие такой реакции, вероятно, связано с накоплением средних молекул, которые представляют собой вторичные эндогенные токсины пептидной природы, появляющиеся при активации протеолитических ферментов в крови и нарушении экскреторной функции почек.

Применение ультрафиолетового облучения выявляло в плазме и эритроцитах у больных при всех токсических формах дифтерии повышенную способность к окислению до 20–25 суток лечения, при этом в мембранах данные явления обнаруживались при субтоксической форме только на 3–4 сутки лечения, при токсической II степени на 6–8 сутки, при токсических I и III степени формах до 20–25 суток пребывания в стационаре.

При токсических формах дифтерии ротоглотки, в отличие от легкой формы болезни, полученные сдвиги спектра фосфолипидов плазмы находились в зависимости от формы инфекционного процесса. При субтоксической форме в плазме выявлялись сдвиги холинсодержащих компонентов фосфолипидов, сохраняющиеся на 3–4 сутки лечения. При токсической I степени форме к аналогичным изменениям в плазме добавлялось изменение содержания фосфатидилинозита, при этом измененный спектр фосфолипидов сохранялся до 6–8 суток лечения. При токсических
II и III степени формах дифтерии к таким же сдвигам, что и при токсической I степени форме, добавлялось изменение содержания фосфатидилсерина в спектре фосфолипидов плазмы, а измененный спектр сохранялся до 20–25 суток лечения, особенно при токсической III степени форме дифтерии.

При исследовании мембранных фосфолипидов практически не измененная концентрация общих фосфолипидов свидетельствовала о сохранении клетками синтезирующих свойств, но изменения фосфолипидного спектра прямо указывали на конформационную перестройку в биомембранах, степень выраженности которой имела прямопропорциональную зависимость от клинической формы дифтерии, и если, при субтоксической форме изменения холинсодержащих компонентов определяли заинтересованность наружного слоя, то при токсических I, II, III степени формах болезни изменения в содержании фосфатидилсерина свидетельствовали о конформации внутреннего слоя биомембран.

Анализ состояния липидного обмена у больных дифтерией показал, что изменение характеристик плазменных липидов, отражающих обмен триацилглицеролов, глицерофосфолипидов, сфингофосфолипидов, холестерина, жирных кислот, косвенно связано с функционированием печени, поджелудочной железы, кишечника, других органов, вовлеченных в патологический процесс, а так же с участием белкового, углеводного обменов в механизме всасывания, синтеза, ресинтеза, поступления в кровь липидов при дифтерийной инфекции. При этом изменение содержания в плазме общих фосфолипидов и их спектра, в большей степени отражающие образование и разрушение мембранных структур клеток, формирование липопопротеидов крови, мицелл желчи, поверхностного слоя альвеол легких, может характеризовать состояние интимных механизмов липидного обмена, происходящих с активацией ферментозависимых процессов: метилирования, гидролиза, декарбоксилирования, фосфорилирования. Факт активации ферментозависимых процессов в крови и клеточных субстанциях в результате прямого и опосредованного действий дифтерийного токсина подтверждают ряд авторов [15, 19].

Повышенное содержание фосфатидилинозита плазмы крови прямо указывало на возможность интенсификации передачи гормонального сигнала клеткам, а так как с синтезом фосфатидилинозитов тесно связано образование кардиолипина, то при дифтерийной инфекции могли возникать проблемы с энергообеспечением клеток и, естественно, дестабилизацией их функций. Аналогичные механизмы повреждения клеток могут возникать при влиянии дифтерийного токсина на цитозольные зоны клеток, путем частичной блокады мембранных рецепторов и частичным входом в клетку, что приводит к запуску апоптоза или замедлению его развития [39].

Данный факт подтверждался перестройкой в биомембранах структурных липидов, происходящей с активацией начальных этапов обмена глицерофосфолипидов и синтеза фосфатидной кислоты. Вероятно, данный процесс сопровождался интенсификацией метилирования фосфолипидов, так как накапливались реактогенные лизофосфатидилхолин и арахидоновая кислота в биомембранах, с другой стороны, в данных условиях могли активироваться фосфолипазы, усиливающие катаболизм глицерофосфолипидов с образованием посредников или предшественников в синтезе БАВ – эйкозаноидов, что приводит к изменению вязкости мембран, их текучести, усилению входа Ca++ в клетку, обеспечивая тем самым адаптационную направленность данного звена патогенеза болезни. Высокая степень конформационных сдвигов в биомембранах указывала на возможность развития или развитие некроза, активации апоптоза клеток, особенно при тяжелых формах дифтерии ротоглотки [34].

Касаясь механизмов нарушения липидного обмена при дифтерийной инфекции и параллельно выявленных нами расстройств СРО в различных средах организма, следует отметить важное значение процессов липопероксидации. При активации последних происходит избыточное образование перекисей, альдегидов, кетонов и свободных радикалов, которые потенцируют действие дифтерийного токсина на клеточные структуры, вызывая модификацию фосфолипидов, нарушение энергетического и пластического обеспечения клеток, функционирования транспортных и рецепторных систем мембран [23, 40], что проявляется в периоде разгара токсических форм дифтерии ротоглотки, а также в более отдаленном периоде при развитии миокардита, полинейропатии, поражения почек. Следовательно, сохранение в динамике болезни повышенной интенсивности СРО, конформации биомембран можно представить, с одной стороны, как патогенетическую реакцию на развившиеся осложнения болезни, с другой, как на необходимые патогенетические условия, при которых осложнения болезни могут развиваться.

Для исследования показателей липидного обмена и свободнорадикального окисления больные острым гепатитом В подразделялись на группы: с легкой, среднетяжелой, тяжелой формами заболевания. Обследование осуществлялось в остром периоде болезни, в 1–2 месяцы реконвалесценции, в 3–6 и 9–12 месяцы периода выздоровления.

При легкой форме острого гепатита В, в разгаре болезни и в периоде реконвалесценции, спонтанная ХЛ биопроб не отличалась от результатов контроля.

Инициация свечения перекисью водорода и ультрафиолетовым облучением свидетельствовала о повышенной способности к окислению в эритроцитах в острой фазе болезни, кроме того, только ультрафиолетовое облучение указывало на небольшую интенсификацию СРО в плазме в остром периоде болезни и в периоде выздоровления. Инициация свечения биопроб двухвалентным железом не выявляла какой-либо разницы с данными контроля.

Слабая активация процессов СРО, и в частности липопероксидации в средах организма, сопровождалась отсутствием изменений в показателях плазменных и мембранных липидов во все сроки обследования больных, что указывало на сохранность физиологических параметров липидного обмена, компенсацию метаболических процессов в биомембранах и клетках, а также в организме в целом при легкой форме гепатита В.

Проведенные исследования спонтанной и индуцированной ХЛ биопроб у больных среднетяжелой и тяжелой формами острого гепатита В позволяли сделать заключение, что максимальная интенсивность процессов СРО в средах организма, с истощением системы антирадикальной защиты, приходилась на острый период болезни. В периоде реконвалесценции интенсивность процессов СРО снижалась и стабилизация состояния свободнорадикальных реакций, в большей части исследованного материала, осуществлялась в первые два месяца реконвалесценции. Однако определенная подвижность системы СРО, включая состояние антиоксидантов и прооксидантов, сохранялась, что выявлялось при применении различных индукторов свечения.

Так, при среднетяжелой форме вирусного гепатита инициация свечения перекисью водорода выявляла повышенную способность к образованию активных форм кислорода в плазме и мембранах до 1–2 месяцев периода выздоровления, в эритроцитах до 9–12 месяцев реконвалесценции.

Применение двухвалентного железа определяло повышенную способность к окислению в эритроцитах и мембранах в остром периоде, плазме до 1–2 месяцев периода выздоровления.

Ультрафиолетовое облучение обнаруживало повышенную способность к окислению в мембранах в остром периоде болезни, в эритроцитах до 1–2 месяцев периода реконвалесценции, в плазме до 9–12 месяцев периода выздоровления.

При тяжелой форме острого гепатита В применение в качестве индуктора перекиси водорода выявляло повышенную способность к окислению в плазме и мембранах до 1–2 месяцев, в эритроцитах до 9–12 месяцев периода реконвалесценции.

Инициация свечения железом указывала на повышенную способность к окислению в эритроцитах и мембранах в острой фазе болезни, в плазме до 3–6 месяцев периода выздоровления.

Использование ультрафиолетового облучения позволяло определить повышенную способность к окислению в мембранах в остром периоде болезни, в эритроцитах до 3–6 месяцев, в плазме до 9–12 месяцев периода реконвалесценции тяжелой формы острого гепатита В.

Исследование показателей плазменных и мембранных липидов у больных с тяжелой и среднетяжелой формами вирусного гепатита выявляло однонаправленность сдвигов, которые выражались в снижении в плазме концентрации общих липидов и общих фосфолипидов в остром периоде болезни, с изменением в фосфолипидном спектре холинсодержащих фракций и сфингомиелина, а в эритроцитарных мембранах снижение концентрации общих фосфолипидов с изменением процентного содержания в их спектре лизофосфатидилхолина, фосфатидилхолина, электронейтрального сфингомиелина и отрицательнозаряженного фосфатидилэтаноламина.

Тяжесть течения болезни влияла на сроки нормализации показателей липидного обмена. При среднетяжелой форме вирусного гепатита восстановление показателей до нормальных величин в плазме происходило в течении 1–2 месяцев периода реконвалесценции, с сохранением подвижности фосфатидилэтаноламинной фракции до 9–12 месяцев периода выздоровления, в мембранах нормализация основных показателей завершалась в такие же сроки, но при этом выявлялось изолированное увеличение фракционного содержания фосфатидилэтаноламина в 3–6 месяцев реконвалесценции с последующей сменой на увеличение содержания сфингомиелина в 9–12 месяцев периода выздоровления.

При тяжелой форме болезни сроки нормализации показателей увеличивались и составили для общих липидов в плазме – 3–6 месяцев периода реконвалесценции, для общих фосфолипидов и их спектра более поздние сроки, в мембранах показатели липидного обмена восстанавливались позднее 3–6 месячного срока обследования реконвалесцентов.

Данные литературы, определяющие в основе формирования патологии печени цитолитический синдром, характеризующийся повышенной проницаемостью мембран гепатоцитов, выходом в кровь индикаторных ферментов, различных внутриклеточных метаболитов, развитием дистрофических и некробиотических процессов в гепатоцитах, с нарушением соотношения процессов СРО, в частности липопероксидации и системы антиоксидантной защиты [10, 36]. Связь усиления перекисной ХЛ с увеличенным содержанием малонового диальдегида и диеновых конъюгат при остром гепатите В установлена Л.Л. Пинским [25]. Усиление ПОЛ, изменение структурной организации липидов, повышение проницаемости мембран, и как следствие, цитолиз гепатоцитов приводятся в работе Н.И. Нисевич с соавторами [22]. Влияние на ДНК клеток активных форм кислорода, повышение цитохрома С и NO• радикалов при вирусных гепатитах приводят ряд авторов [21, 26]. Активация процессов СРО, снижение активности ферментных систем защиты, иммуно-опосредованные проявления при острых вирусных гепатитах [1, 24].

Важная роль в формировании некроза гепатоцитов, развитии воспалительной клеточной инфильтрации как в портальных трактатах, так и в печеночных дольках отводится запуску реакций липопероксидации, повышенной продукции цитокинов, включая ФНО-?, ИЛ-6, ИЛ-8 [4, 10].

Вместе с тем активные формы кислорода и азота, продукты ПОЛ и некротизации гепатоцитов, медиаторы воспаления, включающие ФНО-?, ИЛ-6, ИЛ-8, противовоспалительный ИЛ-10, ростовые факторы активируют стелатные (Ito) клетки, трансформирующиеся в миофибробласты, продуцирующие избыточное количество компонентов соединительной ткани, что приводит к развитию фиброза в печени и определяет группу риска хронизации инфекционного процесса.

Проведенные нами исследования показали, что наряду с активацией липопероксидации и избыточным образованием перекисей, альдегидов, кетонов и свободных радикалов происходят изменения липидного обмена сложного генеза, находящиеся в прямой зависимости от тяжести течения болезни. Изменение показателей плазменных и мембранных липидов происходит по типовой реакции нарушения содержания общих липидов и общих фосфолипидов, процентного соотношения холинсодержащих компонентов, накоплением электронейтрального сфингомиелина и отрицательно заряженного фосфатидилэтаноламина. С одной стороны, сдвиги показателей плазменных липидов отражают обмен триацилглицеролов, глицерофосфолипидов, сфингофосфолипидов, холестерина, жирных кислот косвенно связанных с функционированием, в условиях развившейся патологии, печени, поджелудочной железы, кишечника; с другой отражают образование и разрушение мембранных структур клеток, состояние ферментозависимых процессов, протекающих с активацией метилирования, гидролиза, декарбоксилирования, фосфорилирования, что клинико-морфологически соответствует цитолитическим процессам в гепатоцитах. Последний факт подтверждается сдвигами мембранных липидов при остром гепатите В, которые свидетельствуют о нарушении синтеза фосфолипидов клетками, интенсификации метилирования фосфолипидов, накоплении реактогенных лизофосфатидилхолина и арахидоновой кислоты в биомембранах, изменении вязкости биомембран, текучести, усилении входа Ca++ в клетку. Вероятно, данные процессы имеют максимальную выраженность в гепатоцитах, где усиление метаболизма фосфолипидов и системы циклических нуклеотидов приводит к высвобождению биологически активных веществ типа эйкозаноидов, создавая ситуацию запуска апоптоза или некроза клеток.

Возникающую при этом реакцию воспаления регулируют медиаторы, синтезируемые клетками из эссенциальных полиеновых жирных кислот, депонирующихся в мембранах клеточных органелл в составе фосфолипидов, главным образом в фосфатидилсерине и фосфатидилэтаноламине.

Исследование показателей липидного обмена и СРО у реконвалесцентов острого гепатита В обнаруживало более длительную по отношению к процессам СРО лабильность мембранных липидов, свидетельствующую о сохранении развития типовой реакции по замещению легкоокисляемых фракций фосфолипидов на трудноокисляемые, причем тяжесть течения перенесенного инфекционного процесса сказывалась на накоплении у реконвалесцентов тяжелой формы болезни электронейтральной фракции фосфолипидов в биомембранах, что увеличивало плотность их структуры с вероятной возможностью формирования участков фиброза.

Сохранение дестабилизации мембран в периоде реконвалесценции гепатита В отражает наличие цитолитических процессов в клетках, указывая на возможность хронизации болезни, при этом регистрируемая повышенная активность СРО даже опережает появление высокой активности аминотрансфераз, что получило подтверждение при изучении прочих гемоконтактных гепатитов и в эксперименте на клетках печени [32, 36,43].

Основываясь на вышеизложенном можно предположить, что свертывание цитолитического синдрома в гепатоцитах завершается при среднетяжелой форме болезни в промежутке 3–6 месяцев реконвалесценции, при тяжелой форме острого неосложненного гепатита В на 9–12 месяцах периода выздоровления.

Для реализации поставленных задач исследования больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом были выделены следующие группы обследованных: с легкой, среднетяжелой и тяжелой формами болезни.

У больных с легкой формой болезни изучение процессов СРО и показателей липидного обмена проводилось в острой фазе на I и II неделе болезни; при среднетяжелой и тяжелой формах ГЛПС в доолигоанурическом, олигоанурическом, I неделе полиурического периода. В периоде реконвалесценции, при всех формах тяжести болезни, обследование проводилось в 1, 3, 6, 12 месяцы наблюдения за лицами, перенесшими ГЛПС. Кроме того, была обследована группа лиц с тяжелой формой болезни, которой проводились сеансы гемодиализа.

Согласно произведенным исследованиям при легкой форме ГЛПС, только на I неделе острого периода отмечена повышенная интенсивность процессов СРО в различных средах организма, протекающая с истощением системы антирадикальной защиты. При этом отсутствии сдвигов в структурных липидах биомембран изменения единичных показателей спектра плазменных липидов: фосфатидилхолина на I неделе, фосфатидилинозита на II, свидетельствовали об очень умеренной интенсификации обменных процессов в остром периоде болезни, отражающих состояние рецепторно-мембранозного потенциала.

Применение индукторов свечения в целом подтверждало активацию СРО в острую фазу болезни. С другой стороны, при нормальных показателях спонтанной ХЛ, инициация свечения перекисью водорода указывала на незначительное повышение окислительной способности плазмы в течении I недели болезни, эритроцитов до 6–12 месяцев, мембран до 1 месяца периода реконвалесценции. Инициация свечения железом свидетельствовала о небольшом повышении способности к окислению плазмы, эритроцитов, мембран на I неделе болезни. Ультрафиолетовое облучение информировало о сохранности к повышенной способности к окислению мембран на I неделе болезни, плазмы и эритроцитов до 6–12 месяцев периода реконвалесценции ГЛПС.

Суммируя полученные данные, можно предположить, что в периоде реконвалесценции легкой формы болезни в организме, продолжительностью до 6–12 месяцев, происходят компенсированные свободнорадикальные реакции, без конформационных изменений биомембран и с незначительной активностью общих метаболических реакций организма, что согласовывается с клинико-лабораторным обоснованием присутствия вялотекущего процесса в почках и наличия пояснично-крестцового радикулита в 11,1 % случаев у реконвалесцентов легкого течения ГЛПС.

В острую фазу тяжелой и среднетяжелой форм ГЛПС обнаружено усиление процессов СРО с изменением соотношения системы анти- и прооксидантов во всех исследуемых биопробах. Применение различных индукторов свечения однозначно указывало на усиление процессов СРО в средах организма в острую фазу болезни, но давало разную оценку по способности исследуемого материала к окислению в периоде реконвалесценции. При среднетяжелой форме болезни инициация ХЛ перекисью водорода определяла повышенную способность к окислению и, естественно, избыточное образование активных форм кислорода в плазме и мембранах на протяжении 1 месяца периода выздоровления, в эритроцитах до 12 месяцев периода реконвалесценции. Индукция ХЛ железом выявляла повышенную способность к окислению только в плазме и эритроцитах в течении 1 месяца реконвалесценции. Применение ультрафиолетового облучения повышенную способность к окислению устанавливало в плазме и эритроцитах до 12 месяцев периода выздоровления, при этом реакции на стимуляцию свечения в мембранах не было.

Специфической особенностью действия индукторов свечения, а также прогностическим тестом развития тяжелой формы болезни являлось проявление эффекта гашения ХЛ плазмы в олигоанурическом и полиурическом периодах тяжелого течения ГЛПС после применения двухвалентного железа, что, вероятно, связано с накоплением средних молекул в плазме в результате протеолиза и нарушения экскреторной функции почек.

В периоде реконвалесценции тяжелой формы болезни индуцирование ХЛ перекисью водорода обнаруживало повышенную способность к окислению в плазме и мембранах до 3 месяцев, в эритроцитах до 12 месяцев наблюдения. Индукция свечения железом определяла повышенную способность к окислению в плазме, эритроцитах, мембранах до 3 месяцев периода реконвалесценции. Ультрафиолетовое облучение выявляло повышенную способность к окислению плазмы до 12 месяцев, эритроцитов до 3 месяцев, мембран на протяжении 1 месяца периода выздоровления.

Сопоставление показателей интенсивности свечения биопроб при тяжелой, среднетяжелой, легкой формах ГЛПС показывало, что более тяжелому течению болезни во все периоды острой фазы присущи более выраженные сдвиги уровней спонтанной и индуцированной ХЛ, отражающие интенсивность процессов липопероксидации во всех средах организма. Анализ полученных данных позволяет предположить, что восстановление процессов СРО при легкой форме болезни происходит в течение первого месяца реконвалесценции, при среднетяжелой к третьему месяцу, при тяжелой форме к шестому месяцу после свертывания клиники заболевания.

При исследовании липидного обмена у больных с тяжелой и средне- тяжелой формами геморрагической лихорадки с почечным синдромом в плазме и эритроцитах выявлялись количественные и качественные изменения показателей липидов, максимальные сдвиги которых при среднетяжелой форме приходились на олигоанурический период, при тяжелой форме они равноценно проявлялись во всех периодах острой фазы ГЛПС, начиная с доолигоанурического периода, тем самым предоставляя возможность прогнозировать тяжесть течения болезни.

В условиях выраженного интоксикационного синдрома, сформировавшейся острой почечной недостаточности обнаруженные изменения показателей плазменных липидов, таких как общие липиды и общие фосфолипиды, свидетельствовали о происходящих сдвигах в обмене триацилглицеролов, глицерофосфолипидов, сфингофосфолипидов, холестерина, жирных кислот, имеющих сложный генез, который связан с функционированием печени, поджелудочной железы, кишечника, других органов, а также с участием и состоянием белкового, углеводного обменов, обеспечивающих процессы всасывания, синтеза, ресинтеза, транспорта липидов, что согласуется с данными литературы по нарушению липидного обмена при различных патологических состояниях. При этом сдвиги в содержании общих фосфолипидов и их спектра, с одной стороны, отражают процессы, связанные с образованием и разрушением мембранных структур клеток, с другой, они указывают на связь с процессом формирования липопротеидов крови, мицелл желчи, поверхностного слоя альвеол лёгких, что в целом может характеризовать состояние интимных механизмов липидного обмена, происходящих с активацией ферментозависимых процессов: метилирования, гидролиза, декарбоксилирования, окисления, фосфорилирования, пероксидации.

В эритроцитарных мембранах развивалась типовая реакция по замещению легкоокисляемых фосфолипидов на трудноокисляемые, причём тяжесть течения процесса сказывалась на конформации наружного и внутреннего липидных слоёв мембран. Перестройка структурных липидов при ГЛПС являлась результатом активации начальных этапов обмена глицерофосфолипидов, происходящих с активацией синтеза фосфатидной кислоты в биомембранах [41, 42].

Этот процесс мог сопровождаться интенсификацией метилирования фосфолипидов, так как накапливались реактогенные фосфатидилхолин и арахидоновая кислота, с другой стороны, в данных условиях вероятна активация фосфолипаз, усиливающая катаболизм глицерофосфолипидов с образованием посредников или предшественников в синтезе биологически активных веществ – эйкозаноидов, что приводит к изменению вязкости мембран, их текучести, усилению входа Са++ в клетку, обеспечивая тем самым адаптационную направленность данного звена патогенеза заболевания [33]. Высокая степень конформационных сдвигов в биомембранах указывает на возможность развития или развитие некроза, активации апоптоза клеток, что вероятно и происходит при среднетяжелой и тяжелой формах ГЛПС.

При анализе показателей липидного обмена у больных обращало внимание изменение процентного содержания в фосфолипидном спектре фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, фосфатидилинозита.

Касаясь механизмов выявленных нами общих закономерностей в нарушении липидного обмена, следует отметить данные литературы о билипидных слоях биомембран, в состав которых входят основные представители фосфолипидного спектра, находящиеся вместе с протеинами в асимметричном расположении. Важным фосфолипидным представителем является фосфатидилсерин, который под действием АТФ-зависимого насоса или неселективного насоса участвует вместе с фосфатидилэтаноламином в перемещении к наружному липидному слою мембран. Трансмембранное движение липидов является ферментозависимым процессом, имеющим сложные взаимоотношения фосфолипидных фракций, при которых сфингомиелин, а также церамид, активирующий сфингомиелиназы в плазматических, лизосомальных, ядерных, митохондриальных мембранах, осуществляют трансдукцию сигнала регуляции апоптоза макрофагов. Высокие концентрации сфинголипидов, повышенная активность сфингомиелиназы, повышенное содержание церамида приводят к апоптозу или некрозу макрофагов. Измененное содержание лизофосфатидилхолина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина в биомембранах является активатором фосфатидилсерин-синтаз, благодаря чему увеличивается содержание фосфатидилсерина, который участвует в фагоцитозе и апоптозе клеток, вместе с тем имеются сообщения, связывающие содержание фосфатидилсерина плазматическими мембранами с апоптозом клеток при участии фагоцитирующих макрофагов, активации СРО в мембранах и активации цитохрома С [38]. «Правильное» положение фосфатидилсерина в биомембранах важно для реакций распознавания и слияния клеток, а также стимуляции гиперкоагуляции. Мембранная перестройка фосфатидилсерина имеет значение не только в запуске апоптоза клеток, но и в развитии раннего первичного клеточного некроза.

Экспериментальные исследования по изменению активности фосфохолин-цитидилтрансферазы выявили связь в конкурентном содержании фосфатидилхолина и фосфотидилинозита в биомембранах, контролируемую генетически обусловленным взаимодействием ферментов клетки, генами, затрагивающими эндосоомальное движение [44]. Между тем установлена роль фосфатидилинозита в трансдукции сигнала и механизме перемещения мембранных белков, их сортировке, трансмембранного перемещения под действием киназ, фосфатаз, фосфолипаз в процессе фосфорилирования [35], а, следовательно, в энергообеспечении клеток.

Исследование липидного обмена у лиц, перенесших ГЛПС, выявляло некоторые различия. Так, при среднетяжелой форме болезни сдвиги показателей плазменных и мембранных липидов в основном восстанавливались к 6-му месяцу периода реконвалесценции, при тяжелой же форме заболевания отмечалось наличие «лабильности» показателей фосфолипидов, которые, нормализуясь к трехмесячному сроку периода выздоровления, затем вновь подвергались сдвигам, оставаясь измененными до 12 месяцев периода реконвалесценции. Характерной чертой состояния мембранных фосфолипидов являлось сохранение у реконвалесцентов среднетяжелой формы ГЛПС увеличенного процентного содержания сфингомиелина, у перенесших тяжелую форму болезни – увеличенного содержания фосфатидилэтаноламина.

У реконвалесцентов тяжелой формы болезни обнаруживались две принципиальные особенности: во-первых, происходило усиление синтеза клетками общих фосфолипидов, во-вторых, накапливалась отрицательнозаряженная фракция структуры внутреннего билипидного слоя, влияющая на уплотнение мембран и, вероятно, интенсификацию взаимодействия фосфолипидов с белковыми компонентами клеток, что сопровождало наличие клинических признаков вялотекущего процесса в почках в 16,7 % случаев, пояснично-крестцового радикулита – в 5,5 % случаев в отдаленные сроки реконвалесценции.

Проведенный анализ липидного обмена и процессов СРО в группе обследуемых лиц с тяжелой формой ГЛПС, получавших сеансы гемодиализа выявил аналогичность в сдвигах изучаемых показателей с группой больных тяжелой формы болезни, которым гемодиализ не проводился. Тяжесть болезни, повлекшая назначение сеансов гемодиализа, сопровождалась более выраженными изменениями показателей плазменных и мембранных липидов, более интенсивной спонтанной и индуцированной ХЛ биопроб в олигоанурическом и полиурическом периодах. При этом в полиурическом периоде после проведения гемодиализа выявлялись отличия в содержании фосфатидилсерина и фосфатидной кислоты, что указывало на менее выраженные конформационные процессы билипидного слоя мембран, по сравнению с больными, не получавшими сеансы гемодиализа. Тем не менее, сроки нормализации всех исследуемых показателей в периоде реконвалесценции соответствовали таковым при лечении больных с тяжелой формой болезни без применения гемодиализа. Применение сеансов гемодиализа в острой фазе болезни не вызывало каких-либо сдвигов в уже измененных характеристиках, отражающих процессы СРО и липидный обмен, между тем, в периоде поздней реконвалесценции данная группа обследованных имела в мембранах повышенное содержание трудноокисляемой сфингомиелиновой фракции фосфолипидов, в большей степени присущей структуре клеток нервной ткани, что, возможно, сказывалось на наличии в отдаленные сроки реконвалесценции клиники вялотекущего процесса в почках у 33 %, а поясночно-крестцового радикулита – у 10 % обследованных лиц.

Таким образом, изучение показателей липидного обмена и процессов СРО при ГЛПС свидетельствует о том, что при развивающейся патологии имеет место дестабилизация биомембран, важная роль в которой принадлежит активации процессов липопероксидации. Принимая во внимание тот факт, что специфические механизмы повреждения на первом этапе патогенеза развертываются за счет определенного тропизма возбудителей и их токсинов к тем или иным органам и тканям [11, 16], можно констатировать, что процессы дестабилизации биологических мембран в динамике ГЛПС имеют сложный генез, а наличие структурно – функциональных сдвигов в биомембранах в начале болезни указывает на инициирующую роль возбудителя и его токсических факторов в развитии цитопатогенных эффектов. Углубление процессов дестабилизации мембран в разгаре болезни позволяет утверждать о потенцировании патогенного действия возбудителя и его токсинов на клеточном, органном и системном уровня за счет нарушения микроциркуляции, гемореологии, развития ДВС – синдрома, накопления эндогенных биологически- активных веществ, запуска иммунокомплексных реакций, развития острой почечной недостаточности, нарушений эндокринной и нейрогуморальной регуляции при ГЛПС [3, 5], протекающих с активацией процессов СРО и модификацией плазменных и мембранных липидов.

Сохранение изменений в показателях липидного обмена и процессов СРО в период ранней, до 3 месяцев, и поздней реконвалесценции ГЛПС свидетельствуют о сохранении, вероятно, минимальной структурно-функциональной перестройки в биомембранах, которая сопутствует наличию резидуального синдрома, развитию артериальной гипертензии, нефропатии, нарушению сердечно-сосудистой системы, функционального состояния печени [29].

Резюмируя в целом приведенные в работе данные литературы о функциональной и метаболической значимости выявленных нами сдвигов процессов СРО и показателей липидного обмена при дифтерии ротоглотки, остром гепатите В, ГЛПС, необходимо акцентировать внимание на следующих закономерностях:

1. Развитие типовой реакции дестабилизации мембран при активации процессов СРО в связи со структурными изменениями их липидных и белковых компонентов приводит к нарушениям трансмембранного переноса ионов, электролитного баланса клеток, их возбудимости, утрате мембранных рецепторов и соответственно нервно-гуморального контроля за внутриклеточной метаболической активностью.

2/ Активация процессов СРО в биомембранах, мембранная модификация структурных липидов обеспечивает нарушение системы гемостаза, развитие иммуноопосредованных реакций, накопление медиаторов воспаления, которые могут реализоваться некрозом и/или ускорением апоптоза клеток, сопровождающих основные клинические проявления дифтерии, ГЛПС, острого гепатита В.

3. Длительное сохранение повышенной активности СРО, подвижность структурных липидов сопровождает развитие осложнений при дифтерии ротоглотки, может формировать сроки выздоровления при остром гепатите В, информируя о полноте структурно-функционального восстановления гепатоцитов, может обеспечивать формирование резидуального синдрома у лиц, перенесших ГЛПС.

4. Активация процессов СРО при инфекционной патологии усиливает цитопатические эффекты возбудителей и их токсинов за счет участия в развитии основных патогенетических звеньев.

Суммируя результаты проведенных исследований можно заключить, что активация процессов СРО, изменение показателей липидного обмена в динамике развития дифтерийной инфекции, острого гепатита В, ГЛПС позволяют дополнить существующее представление о патогенезе выше перечисленных инфекционных заболеваний и могут быть использованы для построения системы объективных критериев оценки формы тяжести болезни, развития осложнений, остаточных явлений, возможной хронизации процесса, полноты выздоровления, а также целенаправленного использования в комплексной терапии лекарственных средств антигипоксантного, мембранопротективного, антиоксидантного, ингибиторного в отношении протеаз действия, направленных на нормализацию интимных клеточных механизмов.

Указатель основной литературы

1. Антонова, Т.В. // ЖМЭИ. – 1998. – №5. – С.64–67.
2. Афанасьева, А.Н. // Клинич. медицина – 2004. – №8. – С.37–39.
3. Бабушкина, Ф.А. // Казан. мед. журн. – 2002. – т.83. – №3. – С.194–197.
4. Буеверов, А.О. // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2002.– т.XII – №4. – С.21–25.
5. Быстровский, В.Ф. Функциональное состояние эндокринной системы у больных ГЛПС (Вопр. патогенеза, клиники и лечения): дис. … докт. мед. наук / В.Ф. Быстровский. – СПб., 1996. –306 с.
6. Владимиров, Ю.А. // Биофизика. – 1987. – т.32. – №5. – С.830–844.
7. Гавришева, Н.А., Антонова Т.В. Инфекционный процесс: Клинические и патофизиологические аспекты – СПб., – 1999. – 155 с.
8. Гольдштейн, Н.И. // Биохимия. – 2002. – т.67. – вып.2. – С.194–204.
9. Деконенко, А.Е. // Вопр. вирусологии. – 2004. – №3. – С.40–44.
10. Дудник, Л.Б. // Вопр. мед. химии. – 2000. – т.46. – №6. – С.597–609.
11. Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул – М., – 1985. – 235 с.
12. Журавлев, А.К. // Лаб. дело. – 1985. – №10. – С.586–587.
13. Зенков, Н.К. // Лаб. дело. – 1991. – №8. – С.30.
14. Ибрагимова, Л.А. // Терапевт. арх. – 2000. – №11. – С. 21–24.
15. Изучение проницаемости клеточных мембран эритроцитов больных с дифтерией ротоглотки методом спектра мутности /Н.И. Зрячкин, И.А. Зайцева, В.И. Кленин, О.И. Кулагин и др. // Эфферентная терапия. – 2001. – №3. – С. 63–67.
16. Клер, К.И. // Клинич. микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2000. – т.2. –№1. – С. 4–16.
17. Колб, В.Г., Камышников В.С. Справочник, но клинической химии. – Минск. – 1982. – 366 с.
18. Креатинфосфокиназа как показатель неблагоприятного течения вирусного гепатита /И.М. Рослый, О.С. Литвинова, С.Н. Жаров и др. // Эпидемиология и инфекц. болезни, – 1999. – №1. – С. 46–49.
19. Мельник, Г.В. // Инфекционные болезни. –2005. – т.3. – №2. – С. 41–44.
20. Нагоев, Б.С. // Инфекционные болезни. – 2005. – т.3. – №2. – с 9–12.
21. Нагоев, Б.С. // Терапевт. арх. – 2003. – №11. – С. 15–17.
22. Нисевич, Н.И. // Педиатрия. – 1978. – №6. – С. 44–48.
23. Окислительный стресс в патогенезе антифосфолипидного синдрома / Т.А. Лисицина, Т.М. Решетняк, А.Д. Дурнев, Е.Л. Насонов // Вестн. РАМН. – 2004. – №7. – С. 19–24.
24. Пак, С.Г. // Клинич. медицина – 1991. – №9. – С. 54–57.
25. Пинский, Л.Л. // Врачеб. дело. – 1997. – №6. – С. 56–59.
26. Покровский В.И. // VI Российский съезд врачей–инфекционистов 29–31 октября 2003 года: Тез. докл. – СПб., ВМедА. – 2003. – С. 305.
27. Процессы модификации липопротеинов, физиологическая и патогенетическая роль модифицированных липопротеинов /Л.А. Белова, О.Г. Оглобина, А.А. Белов, В.В. Кухарчук // Вопр. мед. химии. – 2000. – т.46. – №1. – С. 8–21.
28. Рослый, И.М. // Вестн. АМН СССР. – 202. – №8. С. – 3–9.
29. Рощупкин, В.И., Суздальцев А.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. – Куйбышев, 1990. – 82 с.
30. Симакова, А.И. // Эпидемиология и инфекц. Болезни. – 1998. – №1. – С. 49–51.
31. Фархутдинов, Р.Р. // Клинич. медицина. – 1984. – №12. – С. 18–23.
32. Antioxidant status and glutathione metabolism in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis C /P. Boya, A. de la Pena, O. Belogui, E. Larrea, et. all // J. of Hepatology. – 1999. – vol.31. – №5. – P. 808–814.
33. Ca 2+ and phosphatidylinositol 4,5–bisphosphate stabilize a Gbeta gamma–sensitive state of Ca V2 Ca 2+ cannels /M. Rousset, T. Cens, A. Gouin–Charnet et. all // J. Biol. Chem. – 2004. – vol.279. – №15. – P. 14619–14630.
34. Conformation of the diphtheria toxin T domain in membranes: a sitedirected spin–labeling study of the TH8 helix and TL5 loop /K.J. Oh, H.J. Zhau, C. Cui, et. all // Biochim. –
    1999. – vol.38. – №32. – P. 10336–10343.
35. Downes, C.P. // Trends. Cell. Biol. – 2005. – vol.15. – №5. – P. 259–268.
36. Involvement of phosphatidylserine and nonphospholipid components of the hepatitis B virus envelope in human Annexin V binding and in HBV infection in vitro / S. De Meyer, Z.J. Gong, E. Depla, G. Maerteus, S.H. Yap // J. of Hepatology. – 1999. – vol.31. – №5. – P. 783–790.
37. Ito, M. // Food. Chem. Toxicol. – 2005. vol.43. – №3. – P. 461–466.
38. Lipid antioxidant, etoposide, inhibits phosphatidylserine externalization and macrophage clearance of apoptotic cells by preventing phosphatidylserine oxidation / Y.Y. Tyurina, F.B. Serinkan, V.A. Tyurin et. all // J. Biol. Chem. – 2004. – vol.279. – №7. – P. 6056–6064.
39. Liu, X.H. // Proceedings NAS USA. – 1999. – vol.96. – №17. – P. 9563–9567.
40. Quantification of selective phosphatidylserine oxidation during apoptosis /J.P. Fabisiak, Y.Y. Tyurina, V.A. Tyurin, V.E. Kagan // Methods. Mol. Biol. – 2005. – vol.291. – P. 449–456.
41. Sadurska, B. // Postepy. Hig. Med. Dosw. (Online). – 2005. – vol.59. – P. 116–123.
42. Saulnier–Blache, J.S. // Med. Sci. (Paris). – 2004. – vol.20. – №8–9. – P. 799–803.
43. Takayama, F. // Life Sciences. – 2001. – vol.68. – №15. – P. 1807–1815.
44. Weber, U. // Dev. Cell. – 2003. – vol.5. – №4. – P. 559–570.
45. Wu, G.H. // Zhoughua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. – 2003. – vol.24. – №5. – P. 413–415.