Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
Патогенетическое обоснование применения эпидермального фактора роста при термической травме
Лихачева А. Г., Телешева Л. Ф., Долгушин И. И., Осиков М. В.,
2.1. Количественный состав лейкоцитов, популяционный спектр и показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных с термической травмой
Количественный состав лейкоцитов в периферической крови является одним из факторов успешной реализации их функциональной активности. Количество лейкоцитов в крови – наиболее вариабельный из всех гематологических показателей, поскольку изменяется при многих физиологических и патологических состояниях. В тоже время, популяция лейкоцитов чрезвычайно гетерогенна как по морфологии, так и в плане реализации защитных функций: нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы преимущественно участвуют в реакциях врожденного иммунитета, первыми реагируют на повреждение тканей, лимфоциты реализуют адаптивный иммунитет. Апоптоз лимфоцитов является фактором регуляции их количественного представительства в кровотоке и органах иммуногенеза в норме, а также отражает участие лимфоцитов в реализации функциональной активности при патологии.
Количественный состав лейкоцитов периферической крови у больных с термической травмой представлен в табл. 1 и 2. На 1 сутки наблюдения в периферической крови отмечен незначительный лейкоцитоз, общее количество лейкоцитов возросло в среднем на 71 %. Количественный анализ популяционного состава лейкоцитов установил в относительных величинах увеличение палочкоядерных нейтрофилов, в пересчете на абсолютные величины количество лейкоцитов в крови возрастало за счет всех популяций нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. Эозинопения зафиксирована в относительных и абсолютных величинах.
Таблица 1
Количественный состав лейкоцитов периферической
крови у больных с термической травмой
в относительных величинах (М ± m)
|
Группы
Показатели |
Группа 1 Здоровые n = 30 |
Группа 2к ТТ 1 сутки n = 30 |
Группа 3к ТТ 10 сутки n = 30 |
Группа 4к ТТ 20 сутки n = 30 |
|
Эозинофилы, % |
1,33 ± 0,18 |
0,46 ± 0,17 р1-2к < 0,001 |
0,50 ± 0,18 р1-3к < 0,01 |
0,78 ± 0,29 р1-4к < 0,05 |
|
Нейтрофилы |
2,50 ± 0,18 |
7,38 ± 0,38 р1-2к < 0,001 |
11,30 ± 0,51 р1-3к < 0,001 |
6,44 ± 0,35 р1-4к < 0,001 р3к-4к < 0,001 |
|
Нейтрофилы |
59,08 ± 0,96 |
60,85 ± 1,21 |
64,70 ± 0,73 р1-3к < 0,01 |
60,11 ± 0,82 р3к-4к < 0,001 |
|
Нейтрофилы, % |
61,58 ± 0,99 |
68,23 ± 1,18 р1-2к < 0,001 |
76,00 ± 0,80 р1-3к < 0,001 |
66,56 ± 0,72 р1-4к < 0,01 р3к-4к < 0,001 |
|
Лимфоциты, % |
32,08 ± 0,79 |
27,23 ± 2,21 |
18,50 ± 0,61 р1-3к < 0,001 |
29,11 ± 0,84 р1-4к < 0,01 р3к-4к < 0,001 |
|
Моноциты, % |
5,00 ± 0,46 |
4,08 ± 0,36 |
5,00 ± 0,51 |
4,00 ± 0,28 |
Примечание. р – показатель различия между группами по критерию Манна–Уитни.
Механизм развития лейкоцитоза на 1-е сутки термической травмы является многофакторным и по большому счету ложным по своей природе. Во-первых, он обусловлен гемоконцентрацией в связи с выходом плазмы в очаг повреждения, пропитыванием поврежденных тканей и образованием пузырей, заполненных плазмой. Сгущение крови возникает уже в первые минуты после травмы и прогрессирует в последующие часы. Основной его причиной является понижение объема циркулирующей плазмы, возникающее вследствие плазмопотери. О гемоконцентрации при ожогах судят также по увеличению содержания гемоглобина в крови и гематокритному числу. В тоже время, судить по гемоконцентрации о величине падения объема циркулирующей плазмы можно лишь в самом приближенном виде. И.Д. Житнюк в опытах на кроликах установил, что в первые часы после ожога содержание гемоглобина в крови возрастает в большей мере, чем число эритроцитов [27]. Это, казалось бы, является аргументом в пользу того, что количество гемоглобина является более информативным в отношении гемоконцентрации показателем, чем число эритроцитов или гематокритное число. По нашим данным, количество гемоглобина в крови у наблюдаемой группы составило у мужчин 178 ± 2,97 г/л, у женщин 163 ± 3,54 г/л. Более того, количество лейкоцитов в крови нарастает по мере увеличения концентрации гемоглобина (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,52; р < 0,05).
Во-вторых, увеличение количества лейкоцитов может быть связано с их перераспределением в сосудистом русле, увеличением циркулирующего пула преимущественно нейтрофилов за счет демаргинации. Факторами перехода маргинального пула лейкоцитов в циркулирующий могут выступать стресс-реакция и сопутствующий ей выброс катехоламинов и глюкокортикоидов. Wilson и соавторы подчеркивали значение гиперадреналинемии в возникновении раннего лейкоцитоза при термической травме [27]. Кроме того, нельзя исключить экспресс-выход зрелых лейкоцитов из костного мозга. Причем, если демаргинирующий эффект катехоламинов направлен, прежде всего, на гранулоциты, то незначительное повышение уровня глюкокортикоидов на начальных этапах термической травмы вызывает преимущественно перераспределение лимфоцитов [50].
Таблица 2
Количественный состав лейкоцитов периферической крови у больных с термической травмой в абсолютных величинах (М ± m)
|
Группы
Показатели |
Группа 1 Здоровые n = 30 |
Группа 2к ТТ 1 сутки n = 30 |
Группа 3к ТТ 10 сутки n = 30 |
Группа 4к ТТ 20 сутки n = 30 |
|
Лейкоциты, •109/л |
5,33 ± 0,29 |
9,14 ± 0,66 р1-2к < 0,001 |
8,35 ± 0,47 р1-3к < 0,001 |
6,80 ± 0,53 р3к-4к < 0,05 р1-4к < 0,05 |
|
Эозинофилы, •109/л |
0,07 ± 0,01 |
0,04 ± 0,02 р1-2к < 0,01 |
0,04 ± 0,01 р1-3к < 0,01 * |
0,05 ± 0,02 р1-4к < 0,05 * |
|
Нейтрофилы п/ядерные, •109/л |
0,13 ± 0,01 |
0,69 ± 0,05 р1-2к < 0,001 |
0,95 ± 0,07 р1-3к < 0,001 |
0,45 ± 0,04 р1-3к < 0,001 р3к-4к < 0,001 |
|
Нейтрофилы с/ядерные, •109/л |
3,13 ± 0,18 |
5,92 ± 0,51 р1-2к < 0,001 |
5,43 ± 0,34 р1-3к < 0,001 |
4,12 ± 0,35 р1-4к < 0,05 р3к-4к < 0,001 |
|
Нейтрофилы, •109/л |
3,26 ± 0,19 |
6,60 ± 0,54 р1-2к < 0,001 |
6,38 ± 0,39 р1-3к < 0,001 |
4,56 ± 0,38 р1-4к < 0,001 р3к-4к < 0,001 |
|
Лимфоциты, •109/л |
1,69 ± 0,09 |
2,49 ± 0,14 р1-2к < 0,01 |
1,53 ± 0,09 р1-3к < 0,01 * |
1,96 ± 0,14 р3к-4к < 0,001 |
|
Моноциты, •109/л |
0,27 ± 0,03 |
0,39 ± 0,04 р1-2к < 0,01 |
0,40 ± 0,04 р1-3к < 0,01 |
0,28 ± 0,04
|
Примечание. р – показатель различия между группами по критерию Манна-Уитни (* – критерию Вальда-Вольфовитца).
Популяционный спектр лимфоцитов на 1 сутки ТТ изменялся неоднозначно в относительных и абсолютных цифрах (табл. 3). Так, % лимфоцитов, экспрессирующих CD3 + уменьшался, однако количество CD4+ и CD8+ значимо не изменялось, кроме того, отмечен прирост CD71+ клеток, информирующий об активации Т-лимфоцитов. Изменения популяционного состава лимфоцитов в пересчете на 109 клеток/л отражали зафиксированный лимфоцитоз: значимо увеличивалось количество CD4+, CD8+, CD22+, CD71+ лимфоцитов, общее количество Т-лимфоцитов, несущих маркер CD3+, возрастало на правах тенденции.
Таблица 3
Популяционный спектр лимфоцитов у больных
с термической травмой (М ± m)
|
Группы
Показатели |
Группа 1 Здоровые n = 30 |
Группа 2к ТТ 1 сутки n = 30 |
Группа 3к ТТ 10 сутки n = 30 |
Группа 4к ТТ 20 сутки n = 30 |
|
CD3+, % |
67,00 ± 0,25 |
61,62 ± 0,54 р1-2к < 0,001 |
60,10 ± 1,38 р1-3к < 0,001 |
62,13 ± 1,00 р1-4к < 0,001 |
|
CD3+, •109/л |
1,24 ± 0,09 |
1,53 ± 0,08 |
0,93 ± 0,06 р1-3к < 0,001 |
1,19 ± 0,10 р1-4к < 0,01* р3к-4к < 0,01 * |
|
CD4+, % |
36,65 ± 0,65 |
36,23 ± 0,53 |
34,90 ± 1,11 |
36,13 ± 0,24 |
|
CD4+, •109/л |
0,65 ± 0,06 |
0,89 ± 0,05 р1-2к < 0,001 |
0,54 ± 0,04 р1-3к < 0,01 |
0,69 ± 0,06 р3к-4к < 0,01* |
|
CD8+, % |
25,30 ± 0,23 |
24,31 ± 0,40 |
23,30 ± 0,38 р1-3к < 0,01 |
24,88 ± 0,58 р3к-4к < 0,01 |
|
CD8+, •109/л |
0,47 ± 0,03 |
0,59 ± 0,03 р1-2к < 0,01 * |
0,36 ± 0,02 р1-3к < 0,01 |
0,49 ± 0,05 р3к-4к < 0,01 * |
|
CD4/CD8 |
1,48 ± 0,02 |
1,49 ± 0,03 |
1,50 ± 0,04 |
1,46 ± 0,03 р3 < 0,01 |
|
CD22+, % |
18,95 ± 0,76 |
20,38 ± 0,42 |
20,34 ± 1,55 |
18,50 ± 0,47 р3к-4к < 0,01 |
|
CD22+, •109/л |
0,35 ± 0,03 |
0,51 ± 0,04 р1-2к < 0,01 |
0,31 ± 0,02 р1-3к < 0,01 * |
0,35 ± 0,03 |
|
CD16+, % |
16,45 ± 0,52 |
15,62 ± 0,43 |
20,30 ± 1,04 р1-3к < 0,01 |
19,00 ± 1,43 |
|
CD16+, •109/л |
0,31 ± 0,03 |
0,38 ± 0,02 |
0,30 ± 0,02 |
0,37 ± 0,03 |
|
CD25+, % |
14,15 ± 1,58 |
14,00 ± 0,38 |
13,30 ± 0,52 |
11,25 ± 0,57 |
|
CD25+, •109/л |
0,28 ± 0,05 |
0,35 ± 0,03 |
0,21 ± 0,02 |
0,21 ± 0,02 |
|
CD71+, % |
8,67 ± 0,59 |
16,15 ± 0,66 р1-2к < 0,001 |
17,10 ± 0,73 р1-3к < 0,001 |
14,00 ± 0,62 р1-4к < 0,001 |
|
CD71+, •109/л |
0,16 ± 0,02 |
0,41 ± 0,04 р1-2к < 0,001 |
0,27 ± 0,02 р1-3к < 0,001 |
0,27 ± 0,03 р1-4к < 0,01 |
|
HLA-DR+, % |
19,70 ± 0,83 |
19,31 ± 0,53 |
19,40 ± 0,28 |
20,63 ± 0,31 |
|
HLA-DR+, •109/л |
0,37 ± 0,04 |
0,41 ± 0,04 |
0,29 ± 0,02 |
0,39 ± 0,03 |
Примечание. р – показатель различия между группами по критерию Манна–Уитни (* – критерию Вальда-Вольфовитца).
Показательно, что уже на 1 сутки термической травмы в кровотоке возрастает количество клеток, готовых вступить в апоптоз (экспрессирующих CD95+), при этом количество клеток, имеющих морфологические признаки апоптоза, статистически значимо не изменяется при сравнении с группой здоровых людей (табл. 4). Известно, что термическая травма приводит к развитию стресс-реакции и выбросу в кровь основных эффекторов стресса – катехоламинов и глюкокортикоидов. В тоже время, повышение продукции глюкокортикоидов приводит к апоптозу тимоцитов, при котором в отличие от апоптоза большинства других типов клеток не требуется синтез макромолекул de novo [29]. Кроме того, глюкокортикоиды угнетают эозинофилопоэз и вызывают апоптоз зрелых эозинофилов крови, и тем самым снижают содержание эозинофилов в крови вплоть до полного отсутствия.
Таблица 4
Показатели апоптоза лимфоцитов у больных
с термической травмой (М ± m)
|
Группы
Показатели |
Группа 1 Здоровые n = 30 |
Группа 2к ТТ 1 сутки n = 30 |
Группа 3к ТТ 10 сутки n = 30 |
Группа 4к ТТ 20 сутки n = 30 |
|
CD95+, % |
10,45 ± 0,92 |
11,62 ± 0,29 |
15,40 ± 0,79 р1-3к < 0,001 |
14,13 ± 0,51 р1-4к < 0,001 |
|
CD95+, •109/л |
0,20 ± 0,03 |
0,25 ± 0,01 р1-2к < 0,01 |
0,24 ± 0,02 р1-3к < 0,01 |
0,27 ± 0,02 р1-4к < 0,01* |
|
Апоптоз, % |
7,50 ± 0,66 |
7,77 ± 0,44 |
11,20 ± 0,61 р1-3к < 0,001 |
8,63 ± 0,62 |
|
Апоптоз, •109/л |
0,13 ± 0,01 |
0,17 ± 0,02 |
0,17 ± 0,01 р1-3к < 0,01 |
0,17 ± 0,02 |
Примечание. р – показатель различия между группами по критерию Манна–Уитни (* – критерию Вальда-Вольфовитца).
На 10 сутки термической травмы в сравнении со здоровыми пациентами общее количество лейкоцитов в крови оставалось повышенным, в относительных величинах сохранялась эозинопения, наблюдалась выраженная нейтрофилия за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, лимфоцитопения. Пересчет показателей лейкоформулы на 109 клеток/л установил, что увеличение общего количества лейкоцитов обусловлено нейтрофилами и моноцитами, их содержание увеличивалось соответственно на 96 % и 48 %, наряду с этим отмечена лимфоцитопения и эозинопения.
Популяционный спектр лимфоцитов на 10 сутки ТТ изменялся неоднозначно: с одной стороны, отмечено снижение в относительных величиных CD3+, CD8+ лимфоцитов, с другой – увеличение CD16+. Пересчет показателей на количество лимфоцитов в крови выявил снижение CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ и увеличение CD71+. То есть снижение лимфоцитов в крови обусловлено преимущественно Т-клетками и особенно Т-цитотоксическими. Это может быть связано с их выходом из периферической крови и реализацией биологической программы в очаге повреждения, о чем, в частности свидетельствует повышенная экспрессия их активационного маркера (CD71+).
Увеличение количества нейтрофилов в периферической крови, особенно их молодых форм, свидетельствует о стимуляции миелопоэза в ответ на поступление стимулирующих миелопоэз факторов из очага повреждения при термической травме. Известно, что на образование нейтрофильных гранулоцитов необходимо в среднем 4–6 суток. В тоже время, следует учитывать, что характер лейкоцитарной реакции при термической травме зависит от многих факторов: глубины и площади поражения, характера некроза поврежденных тканей (сухой или влажный) и др. Однако в ряде случаев, особенно при тяжело протекающих обширных ожогах с влажным некрозом тканей в крови наблюдается лейкопения. Развитие лейкопении при термической травме может быть обусловлено тем, что большая часть лейкоцитов скапливается в очаге повреждения, поэтому количество лейкоцитов в крови не отражает интенсивность их продукции костным мозгом.
Ведущим механизмом развития лимфоцитопении выступает усиление гибели лимфоцитов путем апоптоза. Количество лимфоцитов, готовых вступить в апоптоз (регистрируемых по экспрессии CD95+) возрастало на 50 % (табл. 5). Кроме того, увеличивалось относительное и абсолютное количество лимфоцитов в кровотоке, несущих морфологические признаки апоптоза. Нами установлена отрицательная корреляция между показателями апоптоза и содержанием в периферической крови общего количества лимфоцитов, популяций Т-звена (CD3+, CD4+, CD8+). Результаты представлены в табл. 5.
Таблица 5
Корреляционная матрица между показателями апоптоза лимфоцитов и их содержанием в крови у больных
на 10 сутки термической травмы
|
Показатели Клетки |
CD95+, % |
CD95+, •109/л |
Апоптоз, % |
Апоптоз, •109/л |
|
Лимфоциты, •109/л |
R = 0,10 |
R = −0,78 |
R = −0,04 |
R = −0,78 |
|
CD3+, % |
R = 0,09 |
R = 0,10 |
R = −0,11 |
R = −0,69 |
|
CD3+, •109/л |
R = 0,06 |
R = −0,66 |
R = 0 |
R = −0,73 |
|
CD4+, % |
R = 0,06 |
R = −0,12 |
R = −0,14 |
R = −0,60 |
|
CD4+, •109/л |
R = 0,07 |
R = −0,71 |
R = −0,09 |
R = −0,72 |
|
CD8+, % |
R = 0,06 |
R = −0,04 |
R = 0,17 |
R = −0,25 |
|
CD8+, •109/л |
R = 0 |
R = −0,68 |
R = 0,09 |
R = −0,84 |
|
CD22+, % |
R = −0,17 |
R = 0,11 |
R = −0,14 |
R = −0,17 |
|
CD22+, •109/л |
R = 0,12 |
R = −0,22 |
R = −0,13 |
R = 0,12 |
|
CD16+, % |
R = 0,03 |
R = 0,08 |
R = −0,24 |
R = 0,08 |
|
CD16+, •109/л |
R = 0,07 |
R = 0,07 |
R = −0,09 |
R = 0,09 |
На 20 сутки термической травмы зафиксирована тенденция к восстановлению количественного состава лейкоцитов в крови. Общее количество лейкоцитов в крови снижается по сравнению с 10 сутками, но остается выше, чем в группе здоровых людей. В лейкоцитарной формуле сохраняется нейтрофильный лейкоцитоз в абсолютных и относительных величинах за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм. Относительное содержание лимфоцитов снижено, однако пересчет их количества на 109/л крови не обнаружил значимых отличий с группой контроля. Количество нейтрофилов снижалось, а количество лимфоцитов увеличивалось при сравнении этих показателей с группой больных на 10 сутки. В тоже время, при CD-типировании лимфоцитов сохранялось снижение клеток, экспрессирующих общий Т-клеточный антиген (CD3+), при этом количество субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+) не отличалось от нормы, более того, становилось выше по сравнению с 10 сутками термической травмы. Кроме того, сохранялась повышенной экспрессия маркера поздней активации Т-лимфоцитов (CD71+). При анализе показателей апоптоза наблюдается увеличение числа клеток, экспрессирующих CD95+, а также клеток, имеющих морфологические признаки апоптоза. Не установлено значимой связи между количеством CD3+ лимфоцитов и количеством лимфоцитов, несущих признаки готовности к апоптозу (R = −0,18; р > 0,05).
Таким образом, при динамическом наблюдении у больных с термической травмой наблюдаются неоднозначные изменения количественного состава лейкоцитов периферической крови. В 1 сутки фиксируется лейкоцитоз, обусловленный перераспределением и гемоконцентрацией. На более поздних этапах, 10–20 сутки, увеличение количества нейтрофилов и моноцитов сочетается с лимфоцитопенией и эозинопенией; лимфоцитопения обусловлена депрессией эффекторов клеточного и гуморального иммунитета: CD3+, CD4+, CD8+, CD22+. Одновременно с этим, на 10–20 сутки термической травмы в крови повышено количество активированных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD71+, а также готовности к апоптозу и морфологические признаки апоптоза. Одним из механизмов лимфоцитопении выступает усиление гибели лимфоцитов путем апоптоза.