Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

2.4. Показатели клеточного врожденного иммунитета при экспериментальной термической травме

На следующем этапе работы нами исследована иммунореактивность организма при экспериментальном моделировании термической травмы. Переход к эксперименту обусловлен не всегда имеющейся возможностью отсроченного (до 1 месяца) наблюдения за больными в клинических условиях. Кроме того, в эксперименте возможно исследование морфологии очага повреждения в динамике после термической травмы. Экспериментальное моделирование термической травмы позволяет в унифицированных по глубине и площади поражениях кожи, в установленные сроки проследить динамику изменений иммунореактивности организма в сопоставлении с формированием и эволюцией морфологии ожоговой раны.

Для создания модели термической травмы использовали плоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, наполненный дистиллированной водой с температурой 100 °С. Площадь ожога в нашем эксперименте составила 12,56 см2, или около 4 % от поверхности тела. Клиническими критериями термической травмы ІІІА являлось формирование пузырей со светлым содержимым, при вскрытии которых дно было розового цвета, струп желтого или светло-коричневого цвета, развитие коагуляционного некроза, распространяющегося до сосочкового слоя дермы. Ожоговая рана формировалась на 2–3 сутки от начала опыта.

Основные клеточные элементы, обеспечивающие реализацию врожденного иммунитета – это фагоциты периферической крови. Однако интенсивность их функциональной активности тесно сопряжена с количественным представительством в крови и зависит от исходного уровня активности в соответствии с правилом Вильдера-Лейтеса [20]. В связи с этим, первоначально исследовали количественный состав популяций лейкоцитов в периферической крови, результаты представлены в табл. 12 и 13. Как видно, на 1 сутки после термической травмы количество лейкоцитов достоверно не изменяется, имеется тенденция к их увеличению. Лейкоцитарная формула в относительных величинах также не претерпевает изменений, однако пересчет показателей на абсолютное количество лейкоцитов обнаружил увеличение нейтрофилов за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, обусловленный, по всей видимости, гемоконцентрацией и перераспределением нейтрофилов в кровотоке.

Значительные изменения количественного состава лейкоцитов зафиксированы на 3 сутки наблюдения: общее количество лейкоцитов увеличилось на 132 % преимущественно за счет нейтрофилов, количество палочкоядерных форм возросло примерно в 6 раз, сегментоядерных – в 2,6 раза. Содержание лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов значимо не отличалось от контрольной группы.

Лейкоцитоз в периферической крови сохранялся на 7 сутки термической травмы, однако в лейкоцитарной формуле в это время наблюдались неоднозначные изменения: количество нейтрофилов сохранялось повышенным и не отличалось от 3 суток наблюдения, но количество лимфоцитов в относительных и абсолютных величинах снижалось на 53 и 18 % соответственно. Такая же картина крови наблюдалась и на 14 сутки эксперимента. Общее количество лейкоцитов, содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов было выше, чем в контрольной группе. Следует отметить снижение выраженности нейтрофильного лейкоцитоза на 14 сутки, о чем свидетельствуют значимые отличия общего количества лейкоцитов и палочкоядерных нейтрофилов в этот период по сравнению с 3 и 7 сутками наблюдения. В тоже время, выраженность лимфоцитопении нарастала, количество лимфоцитов снижалось на 33 % от значений контрольной группы – это минимальный уровень лимфоцитов в периферической крови за весь период наблюдения.

К 21 суткам эксперимента количество лейкоцитов в крови не отличалось от группы интактных, при этом сохранялась нейтрофилия за счет палочкоядерных форм. На 28 сутки термической травмы общее количество лейкоцитов в крови возвращалось к уровню интактных животных, достоверные изменения в лейкоформуле включали только увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов в относительных и абсолютных величинах, при этом их количество было меньше, чем на 3 и 7 сутки наблюдения.

Таблица 12

Количественный состав лейкоцитов в относительных величинах периферической крови
при экспериментальной термической травме (М ± m)

Группы животных

 

 

 

Показатели

Группа 1

Интактные

n = 18

Группа 2к

1 сутки ТТ

n = 8

Группа 3к

3 сутки ТТ

n = 8

Группа 4к

7 сутки ТТ

n = 8

Группа 5к

14 сутки ТТ

n = 8

Группа 6к

21 сутки ТТ

n = 8

Группа 7к

28 сутки ТТ

n = 7

Палочкоядерные нейтрофилы, %

2,78 ± 0,53

4,75 ± 0,92

8,75 ± 1,05*

12,13 ± 1,38*#

8,50 ± 1,10*

8,00 ± 1,11* #

7,00 ± 1,14*

Сегментоядерные нейтрофилы, %

37,11 ± 2,36

44,75 ± 4,86

56,50 ± 2,08*

57,88 ± 2,83*

56,88 ± 2,46*

47,23 ± 3,06*

37,57 ± 5,76^&@

Нейтрофилы, %

39,89 ± 2,19

49,50 ± 4,91

65,25 ± 2,02*#

70,00 ± 2,74*#

65,38 ± 3,33*#

55,43 ± 2,85*^&

44,57 ± 6,42^&@

Лимфоциты, %

50,39 ± 2,04

44,50 ± 5,09

28,63 ± 1,99*#

23,63 ± 3,08*#

24,63 ± 4,02*#

35,79 ± 2,23*

45,86 ± 1,99

Моноциты, %

7,78 ± 1,42

5,38 ± 0,86

5,88 ± 0,44

6,25 ± 0,77

9,50 ± 1,99

9,95 ± 1,85

9,43 ± 1,62

Эозинофилы, %

1,94 ± 0,61

0,38 ± 0,18

0,25 ± 0,25

0,13 ± 0,13

0,50 ± 0,19

0

0,14 ± 0,14

Базофилы, %

0

0,25 ± 0,16

0

0

0

0

0

Примечание. Здесь и далее * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 1, # – группой 2, ^ – группой 3, & – группой 4, @ – группой 5, ~ – группой 6 по критерию Манна–Уитни, WW-критерию Вальда–Вольфовитца.

Таблица 13

Количественный состав лейкоцитов в абсолютных величинах периферической крови
при экспериментальной ТТ (М ± m)

Группы

животных

 

 

Показатели

Группа 1

Интактные

n = 18

Группа 2к

1 сутки ТТ

n = 8

Группа 3к

3 сутки ТТ

n = 8

Группа 4к

7 сутки ТТ

n = 8

Группа 5к

14 сутки ТТ

n = 8

Группа 6к

21 сутки ТТ

n = 8

Группа 7к

28 сутки ТТ

n = 7

Лейкоциты, •109

8,34 ± 0,98

11,75 ± 0,56

19,36 ± 1,84* #

15,30 ± 2,96*

12,11 ± 0,85* ^

10,26 ± 1,25^

11,81 ± 1,28^

Палочкоядерные нейтрофилы, •109/л

0,27 ± 0,06

0,57 ± 0,10*

1,82 ± 0,29* #

2,09 ± 0,66* #

1,08 ± 0,19* ^ &

0,87 ± 0,12*

0,79 ± 0,13*^&

Сегментоядерные нейтрофилы, •109

3,06 ± 0,39

5,24 ± 0,62*

10,89 ± 1,04*#

8,82 ± 1,68*

6,95 ± 0,64*

4,80 ± 0,92^

4,54 ± 0,94^

Нейтрофилы, •109

3,33 ± 0,14

5,81 ± 0,64*

12,70 ± 1,29*#

10,91 ± 2,31*

8,03 ± 0,82*

5,69 ± 0,80*^

5,34 ± 1,04^

Лимфоциты, •109

4,16 ± 0,49

5,25 ± 0,72

5,46 ± 0,58

3,40 ± 0,54*(WW)

2,79 ± 0,29*^(WW)

3,71 ± 0,52

5,44 ± 0,96

Моноциты, •109

0,75 ± 0,16

0,61 ± 0,07

1,18 ± 0,14

0,98 ± 0,20

1,23 ± 0,31

1,03 ± 0,11

1,02 ± 0,13

Эозинофилы, •109

0,11 ± 0,14

0,05 ± 0,02

0,02 ± 0,02

0,01 ± 0,01

0,06 ± 0,02

0

0,02 ± 0,02

Базофилы, •109

0

0,03 ± 0,02

0

0

0

0

0

Таким образом, при экспериментальной термической травме в периферической крови на 3–14 сутки наблюдения фиксируется лейкоцитоз, обусловленный увеличением количества нейтрофилов. Нейтрофилия обусловлена стимуляцией миелоидного ростка костного мозга, о чем свидетельствует значительной увеличение молодых форм нейтрофилов, а срок наблюдения является достаточным периодом от индукции повреждения, формирования очага термической травмы, продукции и секреции аутокоидов миелопоэз-стимулирующего действия до образования нейтрофилов de novo в костном мозге. Лимфоцитопения, зафиксированная на 7–14 сутки наблюдения, вероятно, является следствием, во-первых, усиленной гибели лимфоцитов в кровотоке под влиянием медиаторов воспаления, попадающих в кровь при нарушении автономии очага повреждения и/или их избыточной продукции в очаге, некоторые из которых, в частности ФНО, обладают способностью индуцировать апоптоз лимфоцитов. Во-вторых, как было отмечено выше у больных с термической травмой, снижение лимфоцитов в крови связано с уменьшением продукции одного из факторов пролиферации лимфоцитов ИФН-γ на 10 сутки после повреждения кожи. Наконец, нельзя исключить роль эмиграции лимфоцитов из кровотока в очаг повреждения для обеспечения и участия в репаративных
реакциях.

На следующем этапе нами исследована функциональная активность фагоцитов периферической крови – ключевых клеток врожденного иммунитета. Результаты представлены в табл. 14. Поглотительную способность клеток исследовали по показателям фагоцитоза с частицами монодисперсного полистирольного латекса. Установлено, что уже на 1 сутки термической травмы возрастала активность и интенсивность фагоцитоза соответственно на 78 и 174 %. На 3 и 7 сутки наблюдался динамичный подъем активности и интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа. Так, на 7 сутки % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, увеличился в 1,3 раза, а количество захваченных частиц латекса одним фагоцитом – в 1,06 раза по сравнению с контрольной группой. На 14 сутки поглотительная способность фагоцитов по показателям активности и интенсивности фагоцитоза снижалась при сравнении с 3 и 7 сутками, но оставалась повышенной при сравнении с интактными животными. К 21 суткам наблюдения активность фагоцитоза возвращалась к уровню интактных животных, но интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число оставались повышенными, на 28 сутки количество активно поглощающих фагоцитов, а также количество частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом статистически значимо не отличалось от контрольной группы.

Результаты НСТ-теста установили, что в спонтанных условиях уже на 1 сутки термической травмы возрастает количество фагоцитов, восстанавливающих НСТ, такая активность фагоцитов сохраняется на 3, 7 и 14 сутки эксперимента,
к 21–28 суткам активность НСТ-теста возвращается к уровню интактных животных.

В тоже время интенсивность спонтанного НСТ-теста увеличивается только на 1 сутки и достоверно не отличается от группы контроля в другие сроки наблюдения, что, вероятно, свидетельствует в большей степени об увеличении количества активных фагоцитов в связи с развитием нейтрофильного лейкоцитоза, а не об изменении функциональной активности отдельного фагоцита. Для проведения индуцированного НСТ-теста использовали предварительную активацию фагоцитов частицами монодисперсного полистирольного латекса. Заслуживает внимания факт снижения активности и интенсивности индуцированного НСТ-теста на 3 и 7 сутки после термической травмы. Вероятно, гиперфункция фагоцитов на ранних этапах (1–3 сутки) приводит к снижению их внутриклеточного окислительного функционального резерва. Предположение подтверждают данные корреляционного анализа. Показано, что на 3 и 7 сутки показатели индуцированного НСТ-теста снижаются по мере увеличения показателей спонтанного НСТ-теста: для активности коэффициент корреляции Спирмена R = –0,77 и R = –0,39 соответственно на 3 и 7 сутки (р < 0,05), для интенсивности R = –0,73 и R = –0,33 соответственно
(р < 0,05).

Таблица 14

Функциональная активность фагоцитов периферической крови при экспериментальной термической травме (М ± m)

Группы

животных

 

Показатели

Группа 1

Интактные

n = 18

Группа 2к

1 сутки ТТ

n = 8

Группа 3к

3 сутки ТТ

n = 8

Группа 4к

7 сутки ТТ

n = 8

Группа 5к

14 сутки ТТ

n = 8

Группа 6к

21 сутки ТТ

n = 8

Группа 7к

28 сутки ТТ

n = 7

НСТ-тест спонт., активность, %

18,00 ± 2,46

29,88 ± 4,17*

26,75 ± 2,62*

25,75 ± 2,69*(WW)

26,33 ± 3,75*WW)

25,03 ± 4,99

22,86 ± 1,68

НСТ-тест спонт., интенсивность, у.е.

0,27 ± 0,04

0,43 ± 0,02*

0,35 ± 0,03

0,35 ± 0,04

0,35 ± 0,04

0,34 ± 0,04

0,32 ± 0,02

НСТ-тест индуцир., активность, %

28,90 ± 4,21

25,38 ± 2,53

20,25 ± 2,95*

18,75 ± 2,51*

31,33 ± 3,33

30,35 ± 1,04

27,71 ± 1,98

НСТ-тест индуцир., интенсивность, у.е.

0,40 ± 0,08

0,34 ± 0,03

0,26 ± 0,05

0,26 ± 0,04*

0,44 ± 0,06#

0,41 ± 0,04

0,36 ± 0,03

Активность фагоцитоза, %

31,23 ± 2,76

59,25 ± 3,99*

74,25 ± 2,97*

78,00 ± 3,16*#

53,67 ± 5,85*^&

41,43 ± 5,95^&

45,43 ± 7,15^&

Интенсивность фагоцитоза, у.е.

0,69 ± 0,07

1,89 ± 0,43*

3,54 ± 0,58*

2,76 ± 0,24*

1,76 ± 0,76*

1,54 ± 0,41*^

1,09 ± 0,38^

Фагоцитарное число, у.е.

2,23 ± 0,13

2,99 ± 0,53*

4,59 ± 0,63*

3,49 ± 0,17*

2,86 ± 0,82*

2,71 ± 0,32* ^

2,58 ± 0,45^

Показано, что активация кислородзависимого метаболизма фагоцитов в ранние после термической травмы сроки (1–7 сутки) обусловлена повышением концентрации внутриклеточного Cа2+ и активацией протеинкиназы С, а повышенная генерация активных форм кислорода имеет прямое отношение к расширению зоны очага повреждения [229]. Рядом исследователей НСТ-тест лейкоцитов периферической крови рассматривается как прогностический показатель продолжительности жизни и выживаемости животных после экспериментальной термической травмы кожи. Причем, продолжительность жизни выше в том случае, если после ожога НСТ-тест увеличивается, а затем снижается до нормы, а если НСТ-тест непрерывно растет, то продолжительность жизни снижается. Нами не установлено значимой связи между активностью и интенсивностью НСТ-теста и выживаемостью крыс после термической травмы (коэффициенты корреляции R = 0,12 и R = − 0,01 соответственно; р > 0,05).

Таким образом, установлено, что при экспериментальной термической травме функциональная активность фагоцитов периферической крови изменяется неоднозначно. С одной стороны, увеличивается поглотительная способность фагоцитов с 1 по 21 сутки наблюдения, при этом возрастает как количество активно фагоцитирующих клеток, так и интенсивность захвата объектов фагоцитоза. С другой стороны, показатели спонтанного НСТ-теста возрастают на 1–14 сутки, а функциональный резерв фагоцитов, оцениваемый в индуцированном НСТ-тесте, снижается на 3–7 сутки наблюдения. Функциональная активность фагоцитов полностью восстанавливается к 28 суткам термической травмы.


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074