Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

Патогенетическое обоснование применения эпидермального фактора роста при термической травме

Лихачева А. Г., Телешева Л. Ф., Долгушин И. И., Осиков М. В.,

2.4. Показатели клеточного врожденного иммунитета при экспериментальной термической травме

На следующем этапе работы нами исследована иммунореактивность организма при экспериментальном моделировании термической травмы. Переход к эксперименту обусловлен не всегда имеющейся возможностью отсроченного (до 1 месяца) наблюдения за больными в клинических условиях. Кроме того, в эксперименте возможно исследование морфологии очага повреждения в динамике после термической травмы. Экспериментальное моделирование термической травмы позволяет в унифицированных по глубине и площади поражениях кожи, в установленные сроки проследить динамику изменений иммунореактивности организма в сопоставлении с формированием и эволюцией морфологии ожоговой раны.

Для создания модели термической травмы использовали плоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, наполненный дистиллированной водой с температурой 100 °С. Площадь ожога в нашем эксперименте составила 12,56 см2, или около 4 % от поверхности тела. Клиническими критериями термической травмы ІІІА являлось формирование пузырей со светлым содержимым, при вскрытии которых дно было розового цвета, струп желтого или светло-коричневого цвета, развитие коагуляционного некроза, распространяющегося до сосочкового слоя дермы. Ожоговая рана формировалась на 2–3 сутки от начала опыта.

Основные клеточные элементы, обеспечивающие реализацию врожденного иммунитета – это фагоциты периферической крови. Однако интенсивность их функциональной активности тесно сопряжена с количественным представительством в крови и зависит от исходного уровня активности в соответствии с правилом Вильдера-Лейтеса [20]. В связи с этим, первоначально исследовали количественный состав популяций лейкоцитов в периферической крови, результаты представлены в табл. 12 и 13. Как видно, на 1 сутки после термической травмы количество лейкоцитов достоверно не изменяется, имеется тенденция к их увеличению. Лейкоцитарная формула в относительных величинах также не претерпевает изменений, однако пересчет показателей на абсолютное количество лейкоцитов обнаружил увеличение нейтрофилов за счет палочкоядерных и сегментоядерных форм, обусловленный, по всей видимости, гемоконцентрацией и перераспределением нейтрофилов в кровотоке.

Значительные изменения количественного состава лейкоцитов зафиксированы на 3 сутки наблюдения: общее количество лейкоцитов увеличилось на 132 % преимущественно за счет нейтрофилов, количество палочкоядерных форм возросло примерно в 6 раз, сегментоядерных – в 2,6 раза. Содержание лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов значимо не отличалось от контрольной группы.

Лейкоцитоз в периферической крови сохранялся на 7 сутки термической травмы, однако в лейкоцитарной формуле в это время наблюдались неоднозначные изменения: количество нейтрофилов сохранялось повышенным и не отличалось от 3 суток наблюдения, но количество лимфоцитов в относительных и абсолютных величинах снижалось на 53 и 18 % соответственно. Такая же картина крови наблюдалась и на 14 сутки эксперимента. Общее количество лейкоцитов, содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов было выше, чем в контрольной группе. Следует отметить снижение выраженности нейтрофильного лейкоцитоза на 14 сутки, о чем свидетельствуют значимые отличия общего количества лейкоцитов и палочкоядерных нейтрофилов в этот период по сравнению с 3 и 7 сутками наблюдения. В тоже время, выраженность лимфоцитопении нарастала, количество лимфоцитов снижалось на 33 % от значений контрольной группы – это минимальный уровень лимфоцитов в периферической крови за весь период наблюдения.

К 21 суткам эксперимента количество лейкоцитов в крови не отличалось от группы интактных, при этом сохранялась нейтрофилия за счет палочкоядерных форм. На 28 сутки термической травмы общее количество лейкоцитов в крови возвращалось к уровню интактных животных, достоверные изменения в лейкоформуле включали только увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов в относительных и абсолютных величинах, при этом их количество было меньше, чем на 3 и 7 сутки наблюдения.

Таблица 12

Количественный состав лейкоцитов в относительных величинах периферической крови
при экспериментальной термической травме (М ± m)

Примечание. Здесь и далее * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 1, # – группой 2, ^ – группой 3, & – группой 4, @ – группой 5, ~ – группой 6 по критерию Манна–Уитни, WW-критерию Вальда–Вольфовитца.

Таблица 13

Количественный состав лейкоцитов в абсолютных величинах периферической крови
при экспериментальной ТТ (М ± m)

Таким образом, при экспериментальной термической травме в периферической крови на 3–14 сутки наблюдения фиксируется лейкоцитоз, обусловленный увеличением количества нейтрофилов. Нейтрофилия обусловлена стимуляцией миелоидного ростка костного мозга, о чем свидетельствует значительной увеличение молодых форм нейтрофилов, а срок наблюдения является достаточным периодом от индукции повреждения, формирования очага термической травмы, продукции и секреции аутокоидов миелопоэз-стимулирующего действия до образования нейтрофилов de novo в костном мозге. Лимфоцитопения, зафиксированная на 7–14 сутки наблюдения, вероятно, является следствием, во-первых, усиленной гибели лимфоцитов в кровотоке под влиянием медиаторов воспаления, попадающих в кровь при нарушении автономии очага повреждения и/или их избыточной продукции в очаге, некоторые из которых, в частности ФНО, обладают способностью индуцировать апоптоз лимфоцитов. Во-вторых, как было отмечено выше у больных с термической травмой, снижение лимфоцитов в крови связано с уменьшением продукции одного из факторов пролиферации лимфоцитов ИФН-γ на 10 сутки после повреждения кожи. Наконец, нельзя исключить роль эмиграции лимфоцитов из кровотока в очаг повреждения для обеспечения и участия в репаративных
реакциях.

На следующем этапе нами исследована функциональная активность фагоцитов периферической крови – ключевых клеток врожденного иммунитета. Результаты представлены в табл. 14. Поглотительную способность клеток исследовали по показателям фагоцитоза с частицами монодисперсного полистирольного латекса. Установлено, что уже на 1 сутки термической травмы возрастала активность и интенсивность фагоцитоза соответственно на 78 и 174 %. На 3 и 7 сутки наблюдался динамичный подъем активности и интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа. Так, на 7 сутки % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, увеличился в 1,3 раза, а количество захваченных частиц латекса одним фагоцитом – в 1,06 раза по сравнению с контрольной группой. На 14 сутки поглотительная способность фагоцитов по показателям активности и интенсивности фагоцитоза снижалась при сравнении с 3 и 7 сутками, но оставалась повышенной при сравнении с интактными животными. К 21 суткам наблюдения активность фагоцитоза возвращалась к уровню интактных животных, но интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число оставались повышенными, на 28 сутки количество активно поглощающих фагоцитов, а также количество частиц латекса, поглощенных одним фагоцитом статистически значимо не отличалось от контрольной группы.

Результаты НСТ-теста установили, что в спонтанных условиях уже на 1 сутки термической травмы возрастает количество фагоцитов, восстанавливающих НСТ, такая активность фагоцитов сохраняется на 3, 7 и 14 сутки эксперимента,
к 21–28 суткам активность НСТ-теста возвращается к уровню интактных животных.

В тоже время интенсивность спонтанного НСТ-теста увеличивается только на 1 сутки и достоверно не отличается от группы контроля в другие сроки наблюдения, что, вероятно, свидетельствует в большей степени об увеличении количества активных фагоцитов в связи с развитием нейтрофильного лейкоцитоза, а не об изменении функциональной активности отдельного фагоцита. Для проведения индуцированного НСТ-теста использовали предварительную активацию фагоцитов частицами монодисперсного полистирольного латекса. Заслуживает внимания факт снижения активности и интенсивности индуцированного НСТ-теста на 3 и 7 сутки после термической травмы. Вероятно, гиперфункция фагоцитов на ранних этапах (1–3 сутки) приводит к снижению их внутриклеточного окислительного функционального резерва. Предположение подтверждают данные корреляционного анализа. Показано, что на 3 и 7 сутки показатели индуцированного НСТ-теста снижаются по мере увеличения показателей спонтанного НСТ-теста: для активности коэффициент корреляции Спирмена R = –0,77 и R = –0,39 соответственно на 3 и 7 сутки (р < 0,05), для интенсивности R = –0,73 и R = –0,33 соответственно
(р < 0,05).

Таблица 14

Функциональная активность фагоцитов периферической крови при экспериментальной термической травме (М ± m)

Показано, что активация кислородзависимого метаболизма фагоцитов в ранние после термической травмы сроки (1–7 сутки) обусловлена повышением концентрации внутриклеточного Cа²⁺ и активацией протеинкиназы С, а повышенная генерация активных форм кислорода имеет прямое отношение к расширению зоны очага повреждения [229]. Рядом исследователей НСТ-тест лейкоцитов периферической крови рассматривается как прогностический показатель продолжительности жизни и выживаемости животных после экспериментальной термической травмы кожи. Причем, продолжительность жизни выше в том случае, если после ожога НСТ-тест увеличивается, а затем снижается до нормы, а если НСТ-тест непрерывно растет, то продолжительность жизни снижается. Нами не установлено значимой связи между активностью и интенсивностью НСТ-теста и выживаемостью крыс после термической травмы (коэффициенты корреляции R = 0,12 и R = − 0,01 соответственно; р > 0,05).

Таким образом, установлено, что при экспериментальной термической травме функциональная активность фагоцитов периферической крови изменяется неоднозначно. С одной стороны, увеличивается поглотительная способность фагоцитов с 1 по 21 сутки наблюдения, при этом возрастает как количество активно фагоцитирующих клеток, так и интенсивность захвата объектов фагоцитоза. С другой стороны, показатели спонтанного НСТ-теста возрастают на 1–14 сутки, а функциональный резерв фагоцитов, оцениваемый в индуцированном НСТ-тесте, снижается на 3–7 сутки наблюдения. Функциональная активность фагоцитов полностью восстанавливается к 28 суткам термической травмы.