Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Юров И. Ю., Воинова В. Ю., Ворсанова С. Г., Юров Ю. Б.,

1.3. Происхождение медицинской генетики

Первые данные о моногенных заболеваниях были представлены Уильямом Бэйтсоном (William Bateson) и Арчибальдом Гарродом (Archibald Garrod), которые вместе предположили то, что алкаптонурия – рецессивно наследуемая болезнь. При этом заболевании моча становится темной при экспозиции на воздухе и при взаимодействии со щелочью из-за неспособности пациента метаболизировать гомогентизиновую кислоту. У больных отмечается склонность к артритам крупных суставов. Принимая во внимание вовлечение биохимических процессов при этом заболевании, Гаррод ввел понятие врожденных ошибок метаболизма. Сейчас идентифицированы сотни подобных болезней, описание которых дало начало такой науке, как биохимическая генетика.

В первые десятилетия XX века приобрело широкую известность такое научное направление, как евгеника. В ее основе лежала ранее сформулированная Френсисом Гальтоном (Francis Galton) идея о возможности улучшения породы человека. Евгеника ставила своей целью искоренение наследственных заболеваний путем насильственной стерилизации больных и/или их родителей. В некоторых странах в первой половине XX века были приняты законы о принудительной стерилизации лиц, родивших детей с умственной отсталостью, шизофренией и рядом других заболеваний. Евгеника сыграла отрицательную роль в развитии генетики.

В России генетика успешно развивалась в 20–30 гг. XX века. Большой вклад в развитие генетики внес Николай Константинович Кольцов (1872–1940 гг.), русский биолог, который с 1917 года возглавлял созданный им Институт экспериментальной биологии (ныне Институт биологии развития Российской Академии Наук). Кольцову принадлежит «главная идея ХХ века в биологии» – идея матричного размножения биологических макромолекул («наследственных молекул»). В своем
институте Кольцов развернул исследования по медицинской генетике (первые работы по исследованию групп крови и т.д.), а также по таким вопросам антропогенетики, как наследование цвета волос и глаз, изменчивость и наследственность сложных признаков у однояйцовых близнецов и т.д.

Одним из основоположников клинической генетики в нашей стране стал Сергей Николаевич Давиденков (1880–1961 гг.), который был одновременно невропатологом и генетиком и внес большой вклад в изучение генетики болезней нервной системы. Кроме того, он сформулировал понятие генетической гетерогенности болезней нервной системы, поставил вопрос о создании каталога генов человека, а также способствовал созданию медико-генетического консультирования.

С 1930 г по 1937 г. в медико-биологическом, переименованном затем в медико-генетический институт, под руководством профессора С.Г. Левита (1894–1937 гг.) проводились близнецовые и цитогенетические исследования. Однако, в 1937 г. институт был закрыт, а его директор подвергнут репрессиям. Вплоть до 60-х годов развитие генетики в нашей в стране было остановлено. В ее возрождении в 60-е годы приняли активное участие С.Н. Давиденков, Н.В. Тимофеев-Ресовский, В.П. Эфроимсон, А.А. Прокофьева-Бельговская, С.Н. Ардашников, Е.Ф. Давиденкова и др.

В течение двадцатого столетия стало ясно, что наследственные факторы лежат в основе многих заболеваний. Традиционно наследственные болезни рассматривают под заголовками моногенные, хромосомные и мультифакторные (ошибочно называемые ранее мультифакториальные).

Моногенные болезни. Еще А. Гаррод (A. Garrod) предположил, что кроме алкаптонурии аутосомно-рецессивно наследуются альбинизм и цистинурия. Вскоре последовали другие примеры. К 1966 г. почти 1500 моногенных болезней и признаков было описано, что побудило американского учёного Виктора МакКьюсика (Victor McKusick) к публикации каталога всех известных на тот момент моногенных состояний. К 1998 г., когда было опубликовано двенадцатое издание каталога, в нем содержалось свыше 8500 наименований. Экспоненциальный рост каталога привел к тому, что сейчас он не публикуется в печатном виде, а доступен через сеть Internet как Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (см рекомендуемую литературу). Интересно отметить, что в начале 2007 г. каталог содержал 17370 статей о моногенных болезнях и признаках, среди них аутосомные, сцепленные с хромосомами X и Y, митохондриальные (табл. 1). В настоящее время каталог содержит более 24000 публикаций.

Таблица 1

Статистика каталога OMIM, январь 2007 года

Хромосомные болезни. Совершенствование техники микроскопии привело к открытию в 1959 г. того факта, что дополнительная хромосома 21 в кариотипе (трисомия хромосомы 21) ведет к развитию синдрома Дауна. Вскоре последовали другие подобные открытия. Цитогенетика – наука, изучающая структуру и функции хромосом, на несколько лет стала ведущим направлением в генетике человека. Появление в начале 70-х годов методов дифференциального окрашивания хромосом по длине позволило идентифицировать индивидуальные хромосомы и установить, что потеря или приобретение сегмента хромосомы может быть причиной нарушения развития организма человека.

В настоящее время развивается молекулярная цитогенетика, которая имеет дополнительный методический арсенал для идентификации хромосомных аномалий, включая микроперестройки. Методы молекулярной цитогенетики основаны на специфических биохимических свойствах молекул нуклеиновых кислот, предоставляя возможность детекции последовательностей ДНК и РНК в каждой клетке. Впервые детекция нуклеиновых кислот с использованием радиоактивной метки in situ (непосредственно на препарате) была описана в 1969 г. американскими учеными М.Л. Пардю (M.L. Pardue) и Д. Голлом (D. Gall). Однако понадобилось не одно десятилетие для того, чтобы молекулярно-цитогенетические методы, а именно IISH, нашли свое применение для лабораторной диагностики наследственных заболеваний. Необходимо отметить, что их внедрение в медицинскую практику является заслугой таких известных отечественных ученых, как С.Г. Ворсанова, И.В. Соловьев и Ю.Б. Юров. Впоследствии эти методы были модифицированы с целью определения специфических последовательностей молекул ДНК на хромосомах человека с использованием нерадиоактивных ДНК зондов и, таким образом, было положено начало молекулярно-цитогенетической диагностики с использованием флюоресценции (FISH). С середины 80-х годов они динамично развиваются и начинают использоваться в диагностике хромосомных синдромов и аномалий. В частности, отечественными исследователями было показано, что многие из них являются необходимыми дополнительными методами для уточнения цитогенетического диагноза (Ворсанова и др., 2006; см рекомендуемую литературу).

Далее были разработаны технологии геномной гибридизации: высокоразрешающей метафазной геномной гибридизации и серийной сравнительной геномной гибридизации (HR CGH и arrayCGH). Исследование методом HR CGH проводится на метафазных пластинках с использованием смеси меченых одним флюорохромом геномной ДНК пациента и другим флюорохромом ДНК донора (при исследовании численных хромосомных аномалий) или геномной ДНК какой-то конкретной хромосомы донора (при исследовании структурных хромосомных аномалий). Затем с помощью цифрового анализа производится сравнительная оценка интенсивности суперпозиции сигналов двух разных флюорохромов, в результате чего становится возможным определение приобретения или потери последовательностей ДНК у пациента в строго определенных участках хромосом. При отсутствии количественных изменений в кариотипе исследуемого образца будет наблюдаться соотношение 1:1 интенсивности свечения двух флюорохромов. В случае дупликации интенсивность сигнала соответствующего флюорохрома будет увеличиваться, а в случае потери генетического материала, наоборот, уменьшаться. Метод высокоразрешающей метафазной CGH позволяет идентифицировать несбалансированные хромосомные перестройки с использованием только геномной ДНК. Среди ограничений HR CGH необходимо отметить невозможность выявления мозаицизма и сбалансированных перестроек. Разрешение метода может составить 1–2 млн пн, позволяя использовать высокоразрешающую CGH для диагностики в медико-генетической практике.

Разработка протоколов модификации CGH технологии была направлена на создание высокоразрешающих методов идентификации хромосомных микроаберраций (микроделеций и микродупликаций). В результате этого были созданы методы arrayCGH анализа, а также BAC (ВАС – искусственные бактериальные хромосомы) и олигонуклеотидная CGH. Метод молекулярного кариотипирования или arrayCGH – это анализ, который основан не на гибридизации тотальной геномной ДНК донора и пациента на метафазных хромосомах, как HR CGH, а на замене клеточной суспензии хромосом донора на специфические последовательности ДНК, соответствующие определенным участкам хромосом. Для их иммобилизации используют наночип, на который наносится от нескольких тысяч до нескольких миллионов проб. Затем меченые ДНК гибридизуют на данном чипе. CGH проводится несколькими сериями с использованием цифровых систем детекции суперпозиции сигналов. Модификациями arrayCGH анализа являются ВАС и олигонуклеотидная CGH. Эти технологии имеют большую разрешающую способность за счет применения ВАС ДНК размером от 100 000 до 350 000 пн или олигонуклеотидных последовательностей ДНК размером от 25–100 пн и более. Данные методы используются для идентификации хромосомных микроаберраций, а также генных мутаций, затрагивающих последовательности ДНК, размер которых больше 50 пн. Существует 4 основных разновидностей наночипов:

1) чип с пробами на определенные участки генома;

2) чип, сканирующий геном с разрешением 1 млн пн (расстояние между локализацией каждой пробы составляет примерно 1 млн пн);

3) чип, сканирующий геном «перекрывающими» друг друга ВАС пробами, разрешением около 100 тыс. пн;

4) чип, сканирующий геном с использованием олигонуклеотидных/SNPs проб, разрешением около 1 тыс. пн.

Кроме идентификации потери или приобретения последовательностей ДНК модифицированные протоколы arrayCGH могут быть использованы для высокоразрешающих эпигенетических исследований генома (анализ экспрессии последовательностей ДНК/РНК или метилирования ДНК). Они также применимы для анализа последствий вариаций гетерохроматиновых участков ДНК в плане изменения свойств генов, локализованных в непосредственной близости к этим хромосомным районам. При исследовании геномных вариаций вышеперечисленными технологиями обнаружено, что, помимо ранее описанных хромосомных аномалий, более 5 % последовательностей ДНК генома (включая более 800 генов) участвуют в субмикроскопических хромосомных перестройках, фенотипические проявления которых имеют неочевидные последствия. Для определения степени патогенности выявленной хромосомной перестройки используются следующие приемы:

1) обследование родственников пациента с помощью метода arrayCGH (в первую очередь родителей);

2) создание доступных баз результатов исследований разного разрешения с помощью метода arrayCGH.

Последнее имеет значение для диагностической практики, особенно, применяемое для arrayCGH, позволяющей проводить сравнительный анализ результатов отдельного индивидуума с данными предыдущих исследований.

Исследования методом arrayCGH были признаны одними из наиболее эффективных среди молекулярно-цитогенетических технологий. Разрешение этого метода сравнимо с методами, основанными на FISH, а во многих случаях arrayCGH заменила их (например, исследование субтеломерных делеций). По последним данным, такой анализ выявляет субтеломерные перестройки в 5–25 % случаев умственной отсталости. Это практически в 2 раза больше по сравнению с данными, полученными при более ранних исследованиях. Примечательно то, что, по некоторым данным, вклад субтеломерных делеций, идентификация которых ранее была затруднена вследствие недостаточно высокого уровня разрешения стандартных методов, сравним со вкладом интерстициальных хромосомных перестроек. Более того, применение метода arrayCGH позволило выделить целый ряд достаточно частых и ранее неизвестных микроделеционных синдромов (например, микроделеции в участках 16р11.2-р12.2 и 17q21.31). Помимо этого, вариации генома в виде делеций и дупликаций, определенных с помощью метода высокоразрешающей arrayCGH, достаточно часто обнаруживаются у детей, страдающих аутизмом (до 10 % случаев). Среди индивидуумов с врожденными пороками сердца около 30 % имеют хромосомные микроперестройки, более половина которых достоверно связана с данной патологией. Следует особо отметить, что многие микроперестройки генома при врожденных пороках сердца можно обнаружить только с использованием arrayCGH. Имеются также данные о том, что эта технология позволяет не только уточнить аномалии хромосом в клетках опухолей и при гематологических заболеваниях, но также выявить хромосомные участки для последующего картирования онкогенов, а в некоторых случаях даже непосредственно их выявлять. Эти возможности метода arrayCGH являются исключительно значимыми в пренатальной, доклинической и постнатальной диагностике, а также в прогнозировании, мониторинге и терапевтическом вмешательстве при всех перечисленных заболеваниях, которые в совокупности являются основной причиной инвалидизации как детей, так и в старшем возрасте.

Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что методы молекулярной цитогенетики (особенно следует отметить arrayCGH) являются необходимыми для корректного и эффективного исследования широкого спектра заболеваний, и отсутствие данных технологий в арсенале соответствующих научных и научно-практических учреждений заметно снижает их диагностический потенциал.

Мультифакторные болезни. Френсис Гальтон (Francis Galton) и его последователи пришли к заключению о том, что такие признаки, как рост, цвет кожи могут быть обусловлены взаимодействием многих генов, каждый из которых оказывает определенный аддитивный эффект («аддитивный эффект» – от английского слова «addition» – прибавление) – вид синергизма, при котором эффект действия генов совместно равен сумме эффектов действия каждого в отдельности. Это
контрастирует с характеристиками моногенного наследования, при котором действие одного гена является независимым и неаддитивным. Такая модель широко используется для объяснения наследования многих частых врожденных аномалий (например, расщелина губы и неба), и часто встречающихся в популяции заболеваний (например, сахарный диабет, гипертоническая болезнь).