Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ, МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Юров И. Ю., Ворсанова С. Г., Воинова В. Ю., Чурносов М. И., Юров Ю. Б.,

1.4.2. Хромосомные болезни

Совершенствование техники микроскопии привело к открытию в 1959 году того факта, что дополнительная хромосома 21 в кариотипе (трисомия хромосомы 21) ведет к развитию синдрома Дауна. Вскоре последовали другие подобные открытия. Так в 1960 году был описан синдром Патау (трисомия хромосомы 13), основными признаками которого являются расщелина верхней губы и нёба, поражения ЦНС, при этом наиболее постоянна аринэнцефалия, часто выявляются аплазия и гипоплазия червя мозжечка, голопрозэнцефалия и связанные с ней циклопия, этмоцефалия, цебоцефалия. В том же 1960 году Джон Эдвардс (John Edwards, 1928–2007 гг.) с сотрудниками при цитогенетическом исследовании клеток больных с множественными врождёнными пороками развития обнаружили добавочную (лишнюю) хромосому в кариотипе из группы Е. В дальнейшем эту хромосому определили как 18, и эту трисомию стали называть синдромом Эдвардса. Цитогенетика – наука, изучающая структуру и функции хромосом, на несколько десятилетий стала ведущим направлением в генетике человека. Появление в начале 70-х годов методов дифференциального окрашивания хромосом по длине позволило идентифицировать индивидуальные хромосомы и установить то, что потеря или приобретение сегмента хромосомы может быть причиной нарушения развития организма.

В настоящее время развивается молекулярная цитогенетика, которая имеет дополнительный методический арсенал для идентификации хромосомных аномалий, включая микроперестройки. Методы молекулярной цитогенетики основаны на специфических биохимических свойствах молекул нуклеиновых кислот, предоставляя возможность детекции последовательностей ДНК и РНК в каждой клетке. Впервые детекция нуклеиновых кислот с использованием радиоактивной метки in situ (непосредственно на препарате) была описана в 1969 году американскими учеными М.Л. Пардю (M.L. Pardue, 1933 г. – настоящее время) и Д. Голлом (D. Gall, 1928 г. – настоящее время). Однако понадобилось не одно десятилетие для того, чтобы молекулярно-цитогенетические методы, а именно IISH (isotopic in situ hybridization – изотопная in situ гибридизация), нашли свое применение для лабораторной диагностики наследственных заболеваний. Необходимо отметить, что их внедрение в медицинскую практику является заслугой таких отечественных учёных – молекулярных цитогенетиков, как С.Г. Ворсанова, И.В. Соловьев и Ю.Б. Юров. Впоследствии эти методы были модифицированы с целью определения специфических последовательностей молекул ДНК на хромосомах человека с использованием нерадиоактивных ДНК зондов и, таким образом, было положено начало молекулярно-цитогенетическим исследованиям с использованием флюоресценции (FISH). С середины 80-х годов они динамично развиваются и начинают использоваться в диагностике хромосомных синдромов и аномалий. В частности, отечественными исследователями было показано, что многие из них являются необходимыми дополнительными методами для уточнения цитогенетического диагноза (см рекомендуемую литературу).

Далее были разработаны технологии геномной гибридизации: высокоразрешающей метафазной геномной гибридизации и серийной сравнительной геномной гибридизации (HR CGH и arrayCGH). Исследование методом HR CGH проводилось на метафазных пластинках с использованием смеси меченых одним флюорохромом геномной ДНК пациента и другим флюорохромом ДНК донора (при исследовании численных хромосомных аномалий) или геномной ДНК какой-то конкретной хромосомы донора (при исследовании структурных хромосомных аномалий). Затем с помощью цифрового анализа производилась сравнительная оценка интенсивности суперпозиции сигналов двух разных флюорохромов, в результате чего становилось возможным определение приобретения или потери последовательностей ДНК у пациента в строго определенных участках хромосом. При отсутствии количественных изменений в кариотипе исследуемого образца наблюдается соотношение 1:1 интенсивности свечения двух флюорохромов. В случае дупликации интенсивность сигнала соответствующего флюорохрома будет увеличиваться, а в случае потери генетического материала, наоборот, уменьшаться. Метод высокоразрешающей метафазной CGH позволяет идентифицировать несбалансированные хромосомные перестройки с использованием только геномной ДНК. Среди ограничений метода HR CGH необходимо отметить невозможность выявления мозаицизма и сбалансированных перестроек. Разрешение метода может составить 1–2 млн пар нуклеотидов (пн), позволяя использовать высокоразрешающую CGH для диагностики в медико-генетической практике.

Разработка протоколов модификации CGH технологии была направлена на создание высокоразрешающих методов идентификации хромосомных микроаберраций (микроделеций и микродупликаций). В результате этого были созданы методы arrayCGH анализа, а также BAC (ВАС – искусственные бактериальные хромосомы) и олигонуклеотидная CGH. Метод серийной сравнительной геномной гибридизации (молекулярного кариотипирования) или arrayCGH – это анализ, который основан не на гибридизации тотальной геномной ДНК донора и пациента на метафазных хромосомах, как HR CGH, а на замене клеточной суспензии хромосом донора на специфические последовательности ДНК, соответствующие определенным участкам хромосом. Для их иммобилизации используют наночип, на который наносится от нескольких тысяч до нескольких миллионов проб. Затем меченые ДНК гибридизуют на данном чипе. CGH проводится несколькими сериями с использованием цифровых систем детекции суперпозиции сигналов. Модификациями arrayCGH анализа являются ВАС и олигонуклеотидная CGH. Эти технологии имеют большую разрешающую способность за счет применения ВАС ДНК размером от 100000 до 350000 пн или олигонуклеотидных последовательностей ДНК размером от 25–100 пн и более. Данные методы используются для идентификации хромосомных микроаберраций, а также генных мутаций, затрагивающих последовательности ДНК, размер которых может быть больше 50 пн. Существует 4 основных разновидностей наночипов:

1) чип с пробами на определенные участки генома;

2) чип, сканирующий геном с разрешением 1 млн пн (расстояние между локализацией каждой пробы составляет примерно 1 млн пн);

3) чип, сканирующий геном «перекрывающими» друг друга ВАС пробами, разрешением около 100 тысяч пн;

4) чип, сканирующий геном с использованием олигонуклеотидных/SNPs проб, разрешением около 1 тысячи пн.

Кроме идентификации потери или приобретения последовательностей ДНК модифицированные протоколы arrayCGH могут быть использованы для высокоразрешающих эпигенетических исследований генома (анализ экспрессии последовательностей ДНК/РНК или метилирования ДНК). Они также применимы для анализа последствий вариаций гетерохроматиновых участков ДНК в плане изменения свойств генов, локализованных в непосредственной близости к этим хромосомным районам. При исследовании геномных вариаций вышеперечисленными технологиями обнаружено, что, помимо ранее описанных хромосомных аномалий, более 5 % последовательностей ДНК генома (включая множество генов) участвуют в субмикроскопических хромосомных перестройках, фенотипические проявления которых имеют неочевидные последствия. Для определения степени патогенности выявленной хромосомной перестройки используются следующие приемы:

1) обследование родственников пациента с помощью метода arrayCGH (в первую очередь родителей);

2) создание доступных баз исследований разного разрешения с помощью метода arrayCGH.

Последнее имеет значение для диагностической практики, особенно применительно для arrayCGH, позволяющей проводить сравнительный анализ результатов отдельного индивидуума с данными предыдущих исследований.

Исследования методом arrayCGH были признаны одними из наиболее эффективных среди молекулярно-цитогенетических технологий. Разрешение этого метода сравнимо с методами, основанными на FISH, а во многих случаях arrayCGH заменила их (например, исследование субтеломерных аномалий, микроделеционных/микродупликационных синдромов, на которых мы остановимся отдельно в следующей главе – 1.4.2.1). По последним данным, такой анализ выявляет субтеломерные перестройки в 5–25 % случаев умственной отсталости. Это практически в 2 раза больше по сравнению с данными, полученными при более ранних исследованиях. Примечательно то, что, по некоторым данным, вклад субтеломерных делеций, идентификация которых ранее была затруднена вследствие недостаточно высокого уровня разрешения стандартных методов, сравним с вкладом интерстициальных хромосомных перестроек. Более того, применение метода arrayCGH позволило выделить целый ряд достаточно частых и ранее неизвестных микроделеционных синдромов (например, микроделеции в участках 16р11.2р12.2 и 17q21.31). Помимо этого, вариации генома в виде делеций и дупликаций, определённых с помощью метода высокоразрешающей arrayCGH, достаточно часто обнаруживаются у детей, страдающих аутизмом (до 10 % случаев). Среди индивидуумов с врождёнными пороками сердца около 30 % имеют хромосомные микроперестройки, более половины из которых достоверно связана с данной патологией. Следует особо отметить, что многие микроперестройки генома при врождённых пороках сердца можно обнаружить только с использованием arrayCGH. Имеются также данные о том, что эта технология позволяет не только уточнить аномалии хромосом в клетках опухолей и при гематологических заболеваниях, но и определять хромосомные участки для последующего картирования онкогенов, а в некоторых случаях непосредственно их выявлять. Эти возможности метода arrayCGH являются исключительно значимыми в пренатальной, доклинической и постнатальной диагностике, а также в прогнозировании, мониторинге и терапевтическом вмешательстве при всех перечисленных заболеваниях, которые в совокупности являются основной причиной инвалидизации как детей, так и лиц в старшем возрасте.

Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что методы молекулярной цитогенетики (особенно следует отметить arrayCGH) являются необходимыми для корректного и эффективного изучения широкого спектра заболеваний, включая микроделеционные и микродупликационные синдромы, и отсутствие данных технологий в арсенале соответствующих научных и научно-практических учреждений заметно снижает их исследовательский и диагностический потенциал.