Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

2.4. Технология выращивания культуры водоросли

На практике наиболее распространенными методами биотестирования являются такие, в которых фиксируются, главным образом, такие интегральные параметры, как показатели выживаемости, роста, плодовитости тест-организмов.

Все методы биотестирования характеризуются своими особенностями. Это и доступность тест-объекта, которая определяется возможностью их культивирования в лабораторных условиях, поддержанием необходимых условий температуры, освещенности, сложностью состава питательных сред, чистотой воздуха и пр. Это и оперативность получения ответа.

Наиболее быстрые реакции на токсическое воздействие равных концентраций удается регистрировать у простых организмов – бактерий, водорослей и инфузорий. Наступление таких реакций ограничивается минутами или несколькими часами. Сутками измеряется проявление ответных реакций более крупных объектов (у ракообразных – дафний), а так называемая хроническая токсичность оценивается в течение многих суток и даже недель. Каждый метод характеризуется и своими техническими способами реализации. Общим правилом для всех методик является оценка надежности тест-культур.

В качестве тест – организма в наших экспериментах была использована одноклеточная зеленая водоросль Chlorella vulgaris. Данная водоросль легко культивируется (выращивается) на искусственных питательных средах и быстро размножается. Кроме этого, она широко распространена в природе и хорошо изучена учеными. В качестве питательной среды взята минеральная среда Тамия следующего состава (г/л): КNО3 – 5.0; MgSO4+7H2O – 2,5; KHPO4 – 1,25. Питательная среда и растворы солей готовятся на дистиллированной воде и не подвергаются стерилизации. Для избегания образования осадка, навеску каждого вещества сначала растворяют в небольшом количестве воды, а затем растворы сливают вместе в указанной выше последовательности и доливают воду до соответствующего объема. Перед внесением водорослей питательная среда (100%) разбавляется в 2 раза дистиллированной водой (50%).

 .

Рис.2.2. Культиватор КВ-05

Наращивание исходной культуры водоросли производится в специальном культиваторе КВ-05, рис.2.2. В качестве реактора используется прозрачная бутыль из бесцветного стекла емкостью 400 мл. В реактор заливается суспензия водоросли в объеме 150мл. Для обеспечения углекислым газом, за счет растворения содержащегося в воздухе CO2 и перемешивания суспензии непрерывно вращается вокруг своей продольной оси. В процессе культивирования суспензия водоросли облучается светом лампы накаливания 40 Вт, 220В, установленный над реактором. Постоянная температура поддерживается автоматическим включением и выключением встроенного вентилятора по команде блока термостабилизации прибора.

Засев водоросли производится с начальной оптической плотностью 0,020±0,005. Для этого в 150 мл 50% питательной среды (среда Тамия, разбавленная дистиллированной водой в 2 раза) вносится 15 мл суспензии водоросли, профильтрованной через 3-4 слоя марли с оптической плотностью 0,220. Культура выращивается в полустационарном режиме, который достигается ежедневным пересевом в свежую среду. Такой режим культивирования позволяет без соблюдения условий стерильности поддерживать чистую культуру водоросли. При перерывах в работе свежевыращенную культуры водоросли можно хранить в холодильнике при температуре 2-4 °С в течение 2-4 месяцев. При возобновлении работ по биотестированию хранящуюся культуру водоросли следует активировать, прокультивировав одни сутки в культиваторе «КВ-05», как указано выше.

В качестве показателя светопропускания в приборе ИПТ-02, рис.2.3 используется величина оптической плотности, регистрируемая в круглой кювете («пенициллиновом» флаконе) на красном свету (длина волны 660 нм), который близок по спектру длинноволновому максимуму поглощения хлорофилла. Для уменьшения влияния оптической неоднородности стенок флакона на результаты измерения измерительный свет просвечивает кювету в трех направлениях.

 .

Рис.2.3. Измеритель плотности ИПТ-02

Согласно основному закону светопоглощения, между величиной оптической плотности (D) и концентрацией растворенного вещества в измеряемом растворе существует прямопропорциональная зависимость. Аналогичная связь имеет место между D и количеством клеток в суспензии водоросли. Таким образом, через величину оптической плотности можно оперативно и достаточно точно определить насколько изменилась численность клеток в процессе роста культуры водоросли. Если не требуется высокая точность измерений, допустимо проводить измерение оптической плотности непосредственно во флаконах, в которых выращивались тест-культура. В этом случае после настройки прибора «ИПТ-02» по эталонной кювете с дистиллированной водой все флаконы культиватора «Фитотестер 03» последовательно помещаются в кюветный узел прибора.

Измерение температуры, которое также позволяет делать прибор «ИПТ-02» после его переключения в соответствующий режим работы (Т°), производится выносным датчиком. Чтобы обеспечить более точный и быстрый замер Т° необходимо делать несколько помешивающих движений термодатчиком в измеряемой среде. Для стабилизации температурного режима прибор должен быть включен за 15 минут до начала работы.

С целью изучения зависимости наиболее обобщенного показателя жизнедеятельности культуры водоросли – скорости ее роста – от факторов внешней среды, в том числе и тех, которые оказывают на нее токсическое воздействие, используется многореакторный культиватор «Фитотестер-03», рис.2.4. Данный культиватор представляет собой плоский прямоугольный блок разъемной конструкции, внутри которого расположена круглая кассета для установки в нее флаконов с суспензионными пробами тест-организма. Кассета приводится во вращение электродвигателем, что обеспечивает равномерное перемешивание содержимого всех реакторов и снабжение культуры водоросли углекислым газом, содержащимся в окружающем воздухе. Одинаковое облучение всех проб водоросли осуществляется лампой накаливания мощностью 40 Вт, расположенной внутри корпуса культиватора, рядом с кассетой. Лампа является не только источником световой энергии для фотосинтеза водорослей, но и нагревательным элементом, обеспечивающим нагрев проб тест-культуры.

.

Рис.2.4. Многокюветный культиватор водорослей (Фитотестор-03)

Для предотвращения перегрева реакторов в центре вращающей кассеты установлен вентилятор, который включается каждый раз, когда температура в корпусе прибора превышает установленный уровень. Последний задается термостатирующим устройством, также размещенным в культиваторе. После включения вентилятора происходит быстрое охлаждение внутреннего пространства культиватора более холодным внешним воздухом. При снижении температуры ниже требуемого вентилятор автоматически выключается. Таким образом, с помощью команд, подаваемых вентилятору, осуществляется процесс поддержания необходимой температуры в течение всего периода культивирования проб тест-организма [11].


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074