Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ МЕХАНОХИМИЧЕСКАЯ ПЕРЕРАБОТКА ЛИШАЙНИКОВ РОДА CLADONIA

Аньшакова В. В.,

4.2. Влияние комплексообразования между первичными и вторичными лишайниковыми метаболитами и антибиотическими лекарственными средствами на антибактериальную активность

Несмотря на положительный опыт использования лишайников во многих разделах клинической медицины, в доступной литературе имеются немногочисленные сообщения о применении данного растения. Это связано с тем, что известные методы выделения биоактивных веществ из слоевищ лишайников трудоемки и не дают желаемого результата. Также следует отметить, что применение спиртовых растворов имеет ряд противопоказаний: их нельзя назначать детям, лицам, имеющим алкогольную зависимость и др.

Эффект повышения биоактивности фармакона при его комплексообразовании с лишайниковыми β-олигосахаридами был проверен также при создании механохимического биопрепарата антибактериального действия. Поскольку вторичные метаболиты лишайников, например, лишайниковые кислоты (усниновая, леканоровая, физодовая), обладающие антибиотическим действием, представляют своего рода «внутрилишай-никовый фармакон», было исследовано влияние механохимической активации на антибактериальное действие ягелевого препарата без внесения дополнительных фармаконов. Порошок, состоящий из грубо измельченных слоевищ лишайников и бикарбоната натрия, 0,5 % по массе, помещается в камеру шаровой мельницы (например, АГО-2 или ЦЭМ-7-80) и подвергается механохимической активации в течение 1–2 минут при 1500 об/мин с образованием твердофазного препарата «ЯГЕЛЬ антибактериальный» [Аньшакова и др., 2008]. Сущность биотехнологии состоит в том, что ударно-истирающее воздействие с добавкой твердофазного реагента бикарбоната натрия 0,5 % по массе сопровождается, наряду с разрушением клеточных стенок, изменением химического состава компонентов растительного сырья и переходом их в биодоступную форму в результате разрыва ряда химических связей (даже таких прочных как β-гликозидных) и протеканием механохимических, твердофазных реакций перехода фенольных групп лишайниковых кислот в фенолятные, с последующим их синергетным межмолекулярным взаимодействием с активным наполнителем (рис. 27).

Нами определена сравнительная антибактериальная активность твердофазного препарата ЯГЕЛЬ антибактериальный и препарата, представляющего 40 % водно-спиртовый экстракт ЯГЕЛЬ-М in vitro, в отношении штамма Staphylococcus aureus – 6538-p посредством определения их минимальной ингибирующей концентрации (МИК). Результаты оценки приведены в табл. 15.

Для определения МИК использовались стандартные методики определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а именно, метод приготовления серийных разведений антибактериального препарата в агаре. Твердофазный препарат «ЯГЕЛЬ антибактериальный» при внесении его в питательную среду для равномерного распределения использовали в виде водно – спиртовой (40 %) взвеси. Затем после 2-х суток культивации в термостате при 37,0 °С оценивалась интенсивность роста в зависимости от содержания препарата.

Результаты учитывали визуально, путем подсчета выросших колоний на чашке. Полученные данные интерпретировали следующим образом: отсутствие роста микроба (–) указывает на его чувствительность к препарату. При росте тест-культуры в количестве от 0 до 25 колоний результат оценивали как 1+, от 25 до 50 колоний – как 2+, от 50 до 100 – как 3+. В случае образования на чашке 100 и более колоний микроорганизм считали резистентным (4+).

Таблица 15

Зависимость интенсивности роста культуры St. aureus от концентрации препаратов

Примечание. (–) – отсутствие колоний культуры St. Aureus, (+)...(++++) – наличие колоний культуры St. Aureus в количестве от 25 до 100 и более колоний на чашку.

Таким образом, достоверные данные приведенные в табл. 15 свидетельствуют о том, что минимальная ингибирующая концентрация препарата «ЯГЕЛЬ антибактериальный» в отношении чистой культуры штамма St. aureus составила 2,5 mg/ml, а «ЯГЕЛЬ-М» – 5,0 мг/мл. Отсутствие достоверных различий между образцами обозначенными как «Контроль 1» и «Контроль 2» свидетельствует о неспособности полученных концентраций этилового спирта повлиять на интенсивность роста вышеуказанного штамма микроорганизмов на питательной среде «МЖСА» при стандартных условиях культивирования.

Нами проведены сравнительные исследования антибактериальной активности твердофазных грубоизмельченных на бытовой мельнице (контрольных) и механообработанных слоевищ лищайников по указанной технологии в экспериментах на следующих культурах бактериальных штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов по стандартам мутности культур на 5 и 10 единиц:

Enteroβacter cloacae

Staphylococcus aureus

Лактозо-негативная E.coli

Kleβsiella pneumonia

Proteus vulgaris

Гемолитическая E.coli

E.coli M-17

Salmonella enteritidis Достоверные данные (табл. 16) свидетельствуют о том, что если при внесении в питательные среды для культивирования данных штаммов порошка грубоизмельченных слоевищ лишайников в концентрации 5,0 мг/мл наблюдался очень слабый лизис, то внесение механохимически активированных слоевищ лишайников в той же концентрации приводило к полному лизису бактериальных клеток.

Таблица 16

Антибактериальное действие порошка грубоизмельченного (контроль) и препарата механохимически активированного ягеля на культуры условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов

Примечания: *) +слабый лизис; ++частичное лизирование; +++почти полный лизис; ++++ полный лизис.

Антибактериальное действие полученного препарата «ЯГЕЛЬ антибактериальный» характеризуется в 5–10 раз повышенной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с антибактериальными препаратами, получаемыми стандартными способами, без механоактивации (рис. 29).

Рис. 29. Рост колоний St. aureus на МЖСА с добавлением слоевищ лишайников в виде грубоизмельченной взвеси (справа) и механоактивированных (слева)

Способ механоактивации имеет варианты реализации, заключающиеся в том, что в камеру шаровой мельницы в порошковую смесь добавляют известный антибиотический фармпрепарат (фармакон; например, цефазолин) в массовом соотношении лишайник:фармакон 100:1.

Были проведены сравнительные исследования антибактериального действия комплексного препарата, состоящего из слоевищ лишайника и цефазолина в массовых отношениях 100:1, подвергшейся совместной механохимической обработке и контрольного препарата, состоящего из смеси слоевищ лишайника и цефазолина в таких же массовых отношениях 100:1, но без механохимической активации, полученного грубым помолом на бытовой мельнице.

Определение активности антибактериального действия испытуемого комплексного препарата и грубоизмельченной смеси (контроль) проводили методом серийных разведений на плотных питательных средах. В качестве питательной среды применяли традиционные питательные агаровые среды для выращивания Е.colli. Эффективность антибактериального действия препаратов определяли сроками появления лизиса клеток бактериальной культуры. Сравнения исследуемых образцов проводили из расчета на концентрацию цефазолина.

При действии комплексного препарата на штамм Е.colli М17 отмечалось умеренное бактериостатическое действие в области концентраций цефазолина 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/мл и бактерицидное действие с концентрацией цефазолина свыше
2,0 мкг/мл (табл. 17).

Таблица 17

Антибактериальное действие комплексного препарата ягель с цефазолином механоактивирован. на штамм Е.colli М17

Примечания: *) + – слабый лизис; ++ – частичное лизирование; +++ – почти полный лизис; ++++ – полный лизис.

Цефазолин в составе контрольного препарата не проявлял бактерицидного и бактериостатического действия в области указанных концентраций. Следовательно, цефазолин с концентрацией свыше 2,0 мкг/мл, прошедший совместную механоактивацию с ягелем, оказывает выраженное бактериостатическое действие на штамм Е.colli, в отличии от цефазолина, входящего в состав композита ягеля грубоизмельченного без механоактивации.

Таким образом, созданные механохимические биокомплексы сохраняют свою специфическую биоактивность при существенно меньшей дозе активно действующей субстанции. Следовательно, они менее токсичны, что позволяет при снижении дозы антибиотика почти в 10 раз увеличить антибакте-риальный эффект, снизив тем самым вероятность и скорость формирования устойчивости патогенных (условно-патогенных бактериальных штаммов к соответствующим антибактериальным
препаратам).